運(yùn)蓓蕾， 林 偉， 劉 悅

(遼寧省沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院皮膚科， 遼寧 沈陽(yáng) 110003)

特應(yīng)性皮炎是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，臨床以周期性干燥、發(fā)紅、發(fā)癢的皮膚病變?yōu)樘卣?，病原學(xué)以有缺陷的皮膚屏障、反復(fù)感染以及局部和全身性免疫反應(yīng)為特征，并常伴有過(guò)敏性鼻炎或哮喘[1,2]。該疾病常見(jiàn)于兒童中。在發(fā)達(dá)國(guó)家，兒童期的患病率約為20%，而在發(fā)展中國(guó)家，尤其是在城市化地區(qū)，患病率正在上升[3]。然而，由于特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA 00324(Long non-coding RNA 00324，Linc00324)是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200nt的非編碼RNA，研究表明其在不同疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如Linc00324的表達(dá)量可作為診斷和評(píng)估系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的輔助指標(biāo)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Linc00324的表達(dá)量與CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)。Th17細(xì)胞是CD4+細(xì)胞的成員之一，在特應(yīng)性炎癥等疾病中起重要作用，其中Th17細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)調(diào)控免疫[5]。然而，目前有關(guān)Linc00324和Th17細(xì)胞因子與特應(yīng)性皮炎的發(fā)病關(guān)系尚不清楚?；诖耍狙芯繑M通過(guò)檢測(cè)特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324和Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10的表達(dá)情況，探究其在特應(yīng)性皮炎發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2017年10月至2019年11月在本院經(jīng)病理確診的80例特應(yīng)性皮炎患者為研究對(duì)象，分為特應(yīng)性皮炎輕度組26例，其中男16例，女10例，年齡1～45歲，平均年齡(22.38±3.32)歲，平均體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index，BMI)為(22.02±2.46)kg/m2；特應(yīng)性皮炎中度組24例，其中男11例，女13例，年齡1～48歲，平均年齡(22.92±1.61)歲，平均BMI為(22.89±2.75)kg/m2；特應(yīng)性皮炎重度組30例，其中男16例，女14例，年齡1～50歲，平均年齡(22.09±2.53)歲，平均BMI為(22.12±2.81)kg/m2。同時(shí)選取35例健康人群作為對(duì)照組，其中男19例，女16例，年齡1～55歲，平均年齡(22.16±1.76)歲，平均BMI為(21.43±2.91)kg/m2。各組研究對(duì)象的性別及年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，所有樣品采集均取得受試者及其家屬知情并簽署同意書。特應(yīng)性皮炎患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)免疫學(xué)組編制的《中國(guó)特應(yīng)性皮炎診療指南》所推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②患者及家屬選擇在本院接受治療者；③1～50歲的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料不全者；②免疫功能異常者；③同時(shí)患有可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)估疾病者(如嚴(yán)重內(nèi)分泌、血液系統(tǒng)疾病者)。特應(yīng)性皮炎分度標(biāo)準(zhǔn)：按照《中國(guó)特應(yīng)性皮炎診療指南》規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，①輕度：皮疹面積小于5%；②中度：皮疹面積為5%～10%，或皮疹反復(fù)發(fā)作；③重度：皮損超過(guò)10%體表面積，或皮炎呈持續(xù)性，瘙癢劇烈影響睡眠。

1.2主要試劑與儀器:RNA提取試劑盒(貨號(hào)：ml284600)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：ml7014)均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：SF-1309)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：7500)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)(貨號(hào)：FK-S0197)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)(貨號(hào)：FK-S0176)ELISA試劑盒購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；本研究中其他大部分化學(xué)藥品均購(gòu)自上海晶諾生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存:清晨采集各組研究對(duì)象空腹靜脈血(5mL/人)，離心后收集血清，置于-20℃保存待測(cè)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)血清Linc00324水平:取出血清，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系共20μL，上下游引物各0.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，共40個(gè)循環(huán)。血清Linc00324及內(nèi)參GAPDH的上下游引物序列見(jiàn)表1。采用2-△△CT法計(jì)算血清Linc00324相對(duì)表達(dá)量。引物由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司合成。

表1 引物序列

1.3.3Th17細(xì)胞因子的檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平。具體步驟為：用包被緩沖液稀釋抗體，加至96孔板包被，放置4℃冰箱過(guò)夜。用洗滌液洗板3次，加封閉液室溫孵育1h。再次洗板后加血清樣品，溫室孵育2h。洗滌后加入HRP標(biāo)記的親和素，溫室孵育1h。洗滌后加入底物，反應(yīng)20min，再加入硫酸后停止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

表2 各組研究對(duì)象血清中Linc00324表達(dá)水平

2.1血清Linc00324在特應(yīng)性皮炎及正常對(duì)照組中表達(dá)水平:特應(yīng)性皮炎輕度組、中度組和重度組血清Linc00324水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；中度組和重度組血清Linc00324水平顯著高于輕度組(P<0.05)；重度組血清Linc00324水平顯著高于中度組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2Th17細(xì)胞因子在特應(yīng)性皮炎及正常對(duì)照組中水平的變化:特應(yīng)性皮炎輕度組、中度組和重度組Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；中度組和重度組Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平顯著高于輕度組(P<0.05)；重度組Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平顯著高于中度組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組研究對(duì)象Th17細(xì)胞因子水平的變化

2.3血清Linc00324與Th17細(xì)胞相關(guān)性分析:根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324表達(dá)水平與Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平呈明顯正相關(guān)(r=0.516、r=0.498，P<0.05)，詳見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324、IL-4相關(guān)性分析

圖2 特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324、IL-10相關(guān)性分析

3 討 論

特應(yīng)性皮炎是一種基于皮膚屏障功能障礙的慢性炎癥性皮膚疾病，與遺傳、環(huán)境因素以及免疫系統(tǒng)的多種變化，共同導(dǎo)致彎曲褶皺處的濕疹和瘙癢性皮膚病變以及其他典型表現(xiàn)[7]。特應(yīng)性皮炎的觸發(fā)因素多種多樣，并且涉及的病理生理網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，近年來(lái)其發(fā)病率明顯上升。特應(yīng)性皮炎的發(fā)生、發(fā)展不僅給患者造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還嚴(yán)重影響患者的生活。目前，特應(yīng)性皮炎的病因及具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此，對(duì)特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)理的深入了解及研究是十分必要的。

長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long non-coding RNA, lncRNAs)是人類基因組中本身不被翻譯為蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄本，結(jié)構(gòu)與mRNA類似，其長(zhǎng)度大于200 nt。許多研究已證實(shí)lncRNA參與多種生物學(xué)機(jī)制，調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)多種癌癥及其它疾病的發(fā)生具有重要作用，且對(duì)獲得性免疫疾病具有一定影響[8]。Linc00324又可稱為C17orf44，是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)長(zhǎng)度為3341bp的lncRNA，位于14q13.1號(hào)染色體上[9]。近幾年，隨著人們對(duì)免疫學(xué)層面的深入研究，發(fā)現(xiàn)Linc00324可參與免疫調(diào)控，在自身免疫疾病發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。鮑衛(wèi)等研究發(fā)現(xiàn)[10]，Linc00324在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)明顯上調(diào)，推測(cè)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)；在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的表達(dá)明顯上調(diào)，推測(cè)Linc00324與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的發(fā)生相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324水平顯著高于對(duì)照組，提示血清Linc00324可能參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)生。本研究中重度組、中度組特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324表達(dá)水平顯著高于輕度組，重度組特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324表達(dá)水平顯著高于中度組，提示Linc00324參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)展進(jìn)程。

Th17細(xì)胞是人們近幾年發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，其在自身免疫疾病及多種炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞主要通過(guò)分泌細(xì)胞因子(如IL-4、IL-10和IL-17等)發(fā)揮其功能[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子與慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)病有關(guān)[12]。隨著對(duì)Th17細(xì)胞研究的加深，發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及細(xì)胞因子還與特應(yīng)性皮炎的發(fā)生關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎患者Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平均顯著高于對(duì)照組，提示Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10可能參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)生。本研究中重度組、中度組特應(yīng)性皮炎患者Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平均顯著高于輕度組特應(yīng)性皮炎患者，重度組特應(yīng)性皮炎患者Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平均顯著高于中度組特應(yīng)性皮炎患者，提示Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)展進(jìn)程。且特應(yīng)性皮炎患者血清Linc00324與Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平均呈明顯正相關(guān)，提示兩者可能通過(guò)某種機(jī)制參與調(diào)控特應(yīng)性皮炎的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Linc00324和Th17細(xì)胞因子IL-4、IL-10在特應(yīng)性皮炎患者血清中高表達(dá)，并參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)生及發(fā)展，可作為特應(yīng)性皮炎的早期診斷及病情評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)，具有重要的臨床意義。但對(duì)其具體的作用機(jī)制尚未完全清晰，有待深入研究。