魏建忠， 王 云， 寇士順

(1.北京時(shí)珍堂中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉科， 北京 100071 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院麻醉科， 北京 100020 3.北京中醫(yī)醫(yī)院麻醉科， 北京 100010)

神經(jīng)性疼痛可能由外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，炎癥或疾病引起，其特征在于自發(fā)性疼痛(即持續(xù)性，陣發(fā)性)和痛覺過敏或異常性疼痛形式誘發(fā)性致敏[1,2]。瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(The transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)，是一種非選擇性陽離子通道，由辣椒素，樹脂毒素等外源物激活[3,4]；內(nèi)源性而言，TRPV1通過高溫、酸性pH、N-花生四烯酰乙醇胺、ATP，脂氧合酶產(chǎn)物和單酰基甘油打開。TRPV1作為外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中化學(xué)和有害熱刺激的分子整合劑，能確定機(jī)體對(duì)傷害的反應(yīng)[5,6]。TRPV1可用作選擇性興奮性阻斷劑的載體，特異性阻斷疼痛神經(jīng)纖維傳導(dǎo)也通過選擇性抑制TRPV1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，例如非滲透性鈉通道阻滯劑N-(2,6-二甲基苯基氨基甲?；谆?[7,8]。草烏甲素是二萜類生物堿，自發(fā)現(xiàn)以來一直用于治療慢性疼痛，如癌癥晚期疼痛、良性關(guān)節(jié)痛、腰及四肢關(guān)節(jié)扭傷、挫傷、腰肌勞損及腰背痛等[9]。本研究擬探討草烏甲素通過調(diào)節(jié)TRPV1受體功能減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛的機(jī)制，為神經(jīng)病理性疼痛的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑與儀器:草烏甲素(原料藥，純度99%，重慶賽普那斯科技有限公司，批號(hào)10769-003)；地塞米松(原料藥，純度98%，武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)LM190317)；QuickPrepMicro mRNA純化試劑盒、SYBR Green RT-PCR試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)65415、63127)；抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物試劑盒(上海玉博生物科技有限公司，批號(hào)180613)；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、大鼠抗TRPV1一抗、Tween-20(PBST)試劑(美國(guó)sigma公司，批號(hào)SA1135、SA2017、SA3249)；CAS試劑盒(上海斯信生物科技有限公司，批號(hào)20180519)；生物素化的二抗山羊抗大鼠(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)ab33247)；Fas、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-6(Caspase-6) ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司，批號(hào)：QA698126、MJ471369、OI479512)；Electric Von Frey型電子測(cè)痛儀(天津儀數(shù)科技有限公司)；7370型足底測(cè)試儀(北京拜安吉科技有限公司)；QuantStudio5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；CM3050S型冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.2動(dòng)物飼養(yǎng)及分組:成年SPF級(jí)別SD大鼠由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，6～8周齡，體重212.36～24.63g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(云)2018-0017，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(云)2018-0016，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20180347，在無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)環(huán)境中單籠喂養(yǎng)，溫度受控為(24±1)℃，濕度受控為(50%～60%)，光/暗循環(huán)為12：12h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院關(guān)于動(dòng)物護(hù)理的指導(dǎo)原則和有意識(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性疼痛調(diào)查的倫理指南進(jìn)行。所有大鼠在進(jìn)入試驗(yàn)前1周隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、模型組、地塞米松、草烏甲素低、高劑量組、每組20只，雌雄各半，動(dòng)物自由攝取飼料、自由飲水。

1.3各實(shí)驗(yàn)組的制備:各組大鼠禁食、禁水12h，進(jìn)行L5-脊神經(jīng)結(jié)扎。模型組、地塞米松組、草烏甲素低、高劑量組在氟烷(2%)麻醉下，脊柱左側(cè)附近L5脊神經(jīng)與粘附的組織分離，用四個(gè)6-0絲線松散結(jié)扎，結(jié)扎間距離約1mm，術(shù)后縫合肌肉皮膚層。隨后按照Decosterd和Woolf描述的程序進(jìn)行神經(jīng)損傷程序[10]，在麻醉下，分離股二頭肌，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)及其3個(gè)末端分支，將普通腓骨和脛神經(jīng)用6-0絲線縫合，并在結(jié)扎的遠(yuǎn)端橫切，移除3～5mm的神經(jīng)部分，在手術(shù)過程中保持腓腸神經(jīng)完整，避免與神經(jīng)接觸，注意預(yù)防感染并盡量減少炎癥的影響。對(duì)照組大鼠的L5脊神經(jīng)同樣暴露但未結(jié)扎，并縫合皮膚層和肌肉。草烏甲素組大鼠于造模成功第1天開始給予相應(yīng)藥物鞘內(nèi)注射(注射體積：1.0mL/100g)，具體操作流程為：在麻醉下，在L5和L6椎骨之間插入26G規(guī)格的針頭，注入不同劑量草烏甲素(40、80mg/kg；預(yù)實(shí)驗(yàn)求出草烏甲素LC50為160mg/kg，以1/2 LC50為高劑量，2倍間距為低劑量)，每天1次，持續(xù)給予3周，地塞米松組注入地塞米松(40mg/kg；預(yù)實(shí)驗(yàn)求出地塞米松LC50為80mg/kg，以1/2 LC50為有效劑量組)，對(duì)照組和模型組鞘內(nèi)注射給予等體積生理鹽水。

1.4機(jī)械痛閾值、熱痛閾、疼痛加權(quán)評(píng)分的測(cè)定:Electric Von Frey電子測(cè)痛儀觸壓大鼠左足第3、4趾間的皮膚，測(cè)定機(jī)械痛閾值。使用7370足底測(cè)試儀測(cè)試熱痛，將玻璃地板下面的輻射熱源瞄準(zhǔn)在后爪足足跟底表面上的的脂肪部分，在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)調(diào)節(jié)光的強(qiáng)度，使得平均基線潛伏期為約22s并且施加25s的截止?jié)摲?。在每個(gè)測(cè)試階段中對(duì)每個(gè)后爪進(jìn)行四次潛伏期測(cè)量，在連續(xù)測(cè)試之間至少間隔5min交替測(cè)試每只后爪，將每側(cè)潛伏期的4次測(cè)量平均值作為每次測(cè)試的結(jié)果。PIS評(píng)分=(TⅡ+2×TⅢ+3×TⅣ)÷300，其中TⅡ、TⅢ、TⅣ分別為5min內(nèi)出現(xiàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)的時(shí)間(s)。足掌輕微接觸玻璃缸面，活動(dòng)時(shí)有跛行為Ⅱ級(jí)；足抬起，不接觸玻璃缸面為Ⅲ級(jí)；大鼠舔咬注射足或抽動(dòng)為Ⅳ級(jí)。

1.5TRPV1 mRNA在脊髓組織中表達(dá)的測(cè)定:根據(jù)制造商的說明書使用QuickPrepMicro mRNA純化試劑盒通過單步驟異硫氰酸胍方法分離總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過使用SYBR Green RT-PCR試劑盒進(jìn)行TRAP1基因表達(dá)的PCR分析，TRPV1的引物序列是(F)：5'-GACGCACCGCTCAACAT-3'和(R)：5'-CACATCAAACATGGACGGTTT-3'。GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照，其引物序列為(F)：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'和(R)：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。所有引物均由深圳華大基因股份有限公司純化和合成。實(shí)時(shí)PCR循環(huán)條件是95℃持續(xù)30s的一個(gè)循環(huán)，接著是95℃持續(xù)5s和60℃持續(xù)34s的40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算TRPV1 mRNA水平。

1.6TRPV1 蛋白在脊髓組織中表達(dá)的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行椎板切除術(shù)解剖脊髓的L5-6區(qū)段，并在4%多聚甲醛中固定6h，之后將它們?cè)?℃下浸入30%蔗糖中48h。在冷凍切片機(jī)上將冷凍組織切成3mm的厚度。使用抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物方法處理組織切片用于免疫染色。具體操作步驟為：將切片用0.05M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，并在3%過氧化氫中溫育10min。漂洗后，將切片用CAS塊在室溫下封閉10min，然后在4℃下在PBS中與大鼠抗TRPV1一抗(1：500)孵育過夜。用含有Tween-20(PBST)的PBS依次沖洗切片，然后在室溫下與生物素化的二抗山羊抗大鼠(1：1000)一起溫育2h，并用于定量TRPV1蛋白表達(dá)。

1.7大鼠脊髓Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達(dá)水平的測(cè)定:快速收獲L5脊髓背角的背側(cè)象限并在PBS中勻漿，然后在4℃下以13000×g離心15min，收集上清液用于測(cè)量Fas、Caspase-3、Caspase-6的濃度，使用相應(yīng)的ELISA試劑盒。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠機(jī)械痛閾值、熱痛閾、PIS評(píng)分的比較:與對(duì)照組比較，模型組機(jī)械痛閾值、熱痛閾降低，PIS評(píng)分升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組機(jī)械痛閾值、熱痛閾升高，PIS評(píng)分降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組機(jī)械痛閾值、熱痛閾高于草烏甲素低劑量組(P<0.05)，PIS評(píng)分低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組機(jī)械痛閾值、熱痛閾降低，PIS評(píng)分升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠機(jī)械痛閾值熱痛閾P(yáng)IS評(píng)分的比較

2.2各組大鼠脊髓組織HE染色比較:對(duì)照組脊髓區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，染色清晰；模型組脊髓區(qū)可見大量壞死神經(jīng)元，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；地塞米松組及草烏甲素高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，神經(jīng)元細(xì)胞壞死程度減輕；草烏甲素低劑量組仍可見明顯脊髓破壞，見圖1。

圖1 各組大鼠右側(cè)脊髓組織HE染色比較(400×)

2.3各組大鼠脊髓TRPV1 mRNA表達(dá)水平比較:與對(duì)照組比較，模型組TRPV1 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組TRPV1 mRNA水平降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組TRPV1 mRNA水平低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組TRPV1 mRNA水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠脊髓TRPV1 mRNA表達(dá)水平比較

圖2 草烏甲素對(duì)各組大鼠脊髓部TRPV1表達(dá)的影響(400×)

表3 各組大鼠脊髓TRPV1蛋白表達(dá)水平比較

2.4各組大鼠脊髓TRPV1 蛋白表達(dá)水平比較:免疫組化法下，TRPV1 主要定位于胞核，其陽性表達(dá)為棕褐色，見圖2。與對(duì)照組比較，模型組TRPV1蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組TRPV1 蛋白水平降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組TRPV1 蛋白水平低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組TRPV1 蛋白水平升高(P<0.05)，見表3。

2.5各組大鼠脊髓Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達(dá)水平比較:與對(duì)照組比較，模型組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平降低(P<0.05)，且草烏甲素高劑量組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平低于草烏甲素低劑量組(P<0.05)；與地塞米松組比較，草烏甲素低、高劑量組Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白水平升高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠脊髓Fas Caspase-3 Caspase-6蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

草烏甲素已應(yīng)用于諸多神經(jīng)病變疼痛中，如三叉神經(jīng)痛，疼痛性糖尿病神經(jīng)病變，復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合征(CRPS)和帶狀皰疹后神經(jīng)痛。草烏甲素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)性疼痛的作用正在被認(rèn)識(shí)到[11]。研究表明，草烏甲素對(duì)含乙酰膽堿的神經(jīng)末梢具有選擇性，通過切割突觸體相關(guān)蛋白SNAP-25抑制突觸前囊泡中的乙酰膽堿釋放，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的新證據(jù)表明草烏甲素對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)劑和發(fā)射體的釋放具有許多額外的抑制作用，這對(duì)神經(jīng)傳遞感覺通路至關(guān)重要。在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元中，草烏甲素抑制蛋白激酶C(PKC)介導(dǎo)的可溶性N乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)依賴性胞外分泌瞬時(shí)TRPV1至質(zhì)膜。人體研究進(jìn)一步證明草烏甲素可減少由辣椒素(一種TRPV1受體激動(dòng)劑)誘導(dǎo)的疼痛和神經(jīng)源性炎癥[12,13]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，地塞米松組、草烏甲素各劑量組機(jī)械痛閾值、熱痛閾升高，PIS評(píng)分降低，且草烏甲素高劑量組機(jī)械痛閾值、熱痛閾高于草烏甲素低劑量組，PIS評(píng)分低于草烏甲素低劑量組；這與上述討論符合，同時(shí)也說明草烏甲素能明顯減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠疼痛。結(jié)合各組大鼠脊髓組織HE染色，結(jié)果顯示，對(duì)照組脊髓區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，染色清晰；模型組脊髓區(qū)可見大量壞死神經(jīng)元，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；地塞米松組及草烏甲素高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，神經(jīng)元細(xì)胞壞死程度減輕。這說明草烏甲素能減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷壞死。

本研究同時(shí)探討了草烏甲素對(duì)脊髓神經(jīng)元凋亡作用的影響，其結(jié)果顯示草烏甲素能明顯抑制脊髓神經(jīng)元凋亡。研究已證實(shí)TRPV1通道在傷害性和神經(jīng)性疼痛中的核心作用。TRPV1在小直徑感覺傳入C纖維和Ad纖維中表達(dá)，這些神經(jīng)纖維包含各種神經(jīng)肽，如P物質(zhì)和/或降鈣素基因相關(guān)肽；TRPV1也存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和非神經(jīng)元組織中[14]。在神經(jīng)損傷引起的熱痛覺過敏和糖尿病神經(jīng)病變期間，均發(fā)現(xiàn)TRPV1的表達(dá)水平明顯升高。本次研究結(jié)果表明，地塞米松組、草烏甲素各劑量組TRPV1 mRNA和蛋白水平低于模型組，且草烏甲素高劑量組TRPV1 mRNA和蛋白水平低于草烏甲素低劑量組；這與上述討論符合，同時(shí)也提示草烏甲素能抑制TRPV1的表達(dá)。草烏甲素抑制TRPV1受體/通道表達(dá)的機(jī)制尚不完全清楚，但可能與其阻斷神經(jīng)元胞吐作用的能力有關(guān)。據(jù)報(bào)道[15]，TRPV1通道向神經(jīng)元表面的活性依賴性遞送可能有助于外周傷害感受器終端中熱性痛覺過敏的累積和維持。草烏甲素可阻斷由佛波酯或代謝型谷氨酸受體mGluR5激活的PKC誘導(dǎo)的TRPV1膜易位，因?yàn)門RPV1的軸突表達(dá)取決于與SNARE復(fù)合物的蛋白質(zhì)的相互作用，草烏甲素可導(dǎo)致SNAP-25復(fù)合物的去穩(wěn)定化因此抑制TRPV1對(duì)細(xì)胞表面的SNARE依賴性胞吐作用，降低周圍神經(jīng)軸突中的TRPV1表達(dá)。本研究同時(shí)探討了草烏甲素對(duì)大鼠脊髓凋亡蛋白Fas、Caspase-3、Caspase-6蛋白的影響，結(jié)果顯示，草烏甲素可抑制大鼠脊髓凋亡蛋白Fas、Caspase-3、Caspase-6表達(dá)，提示草烏甲素抑制脊髓神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，草烏甲素能減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制與草烏甲素抑制TRPV1受體功能進(jìn)而抑制脊髓神經(jīng)元凋亡有關(guān)。