單洪偉， 于 鵬， 劉 寬， 于明超，馬 甡

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003； 2.通威股份有限公司，四川 成都 610041)

益生菌可以促進蝦的生長、影響其消化酶活力、增強其免疫應答水平、提高其對病原菌的抵抗能力等，被廣泛應用于對蝦養(yǎng)殖中[1-2]。目前，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖常用的益生菌種類包括光合細菌、酵母菌(Saccharomycessp.)、乳酸菌(Lactobacillussp.)及芽孢桿菌(Bacillussp.)等。其中，由于芽孢桿菌在養(yǎng)殖環(huán)境中分布廣泛，致病性較低，已經(jīng)在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中廣泛應用并取得了很好的效果。飼料添加是益生菌主要應用方式之一，除了直接在飼料中添加菌體外，細菌源活性物質(zhì)，如肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等可以作為免疫增強劑添加到飼料中以提高水產(chǎn)動物的抗病力[3-4]。

生物機體的能量代謝與各種生理功能密切相關，其在機體生長、繁育以及細胞穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)之間的分配存在一種利于自我生存的調(diào)控平衡態(tài)，一旦失衡就會引發(fā)組織功能紊亂，影響到機體整體的活力以及健康水平[5-6]。已有研究表明，凡納濱對蝦在感染白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)后，能量代謝過程遭到破壞，機體能量代謝速率變緩，并會引發(fā)Warburg 效應，使體內(nèi)乳酸含量增加，最終導致死亡[7-8]。因此，凡納濱對蝦的能量代謝與其抗病能力密切相關。但是目前，基于能量代謝角度探討益生菌相關作用機制的研究較少。

該實驗以前期篩選得到的一株芽孢桿菌為實驗材料，粗提取其胞外蛋白和胞內(nèi)多糖組分后與配合飼料混合并飼喂凡納濱對蝦，探究芽孢桿菌2種粗提物對凡納濱對蝦生長、能量代謝水平、消化酶活力及抗WSSV能力的影響。本研究一方面為芽孢桿菌功能組分在對蝦養(yǎng)殖中的應用提供基礎資料，另一方面嘗試從能量代謝的角度闡明芽孢桿菌的益生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和條件

1.1.1 實驗菌株及組分提取 以本實驗室篩選出的芽孢桿菌BZ5株為實驗菌株。該菌株篩選自浙江舟山凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘，經(jīng)16SrRNA基因序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建結(jié)果顯示，該菌株與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)親緣關系最近，前期研究結(jié)果表明其能夠提高對蝦抗WSSV能力[9]。

芽孢桿菌BZ5株胞外蛋白粗提物的提取采用硫酸銨沉淀法[10]。主要操作如下：將芽孢桿菌發(fā)酵液離心(4 ℃, 10 000 r/min, 10 min)后，在上清液中加入硫酸銨至80%飽和。靜置24 h后再次離心(4 ℃, 10 000 r/min, 20 min)，并收集沉淀。沉淀用一定量的PBS溶解后，用蒸餾水進行透析。透析液凍干后，即得到芽孢桿菌胞外蛋白粗提物。

芽孢桿菌BZ5株胞內(nèi)多糖粗提物的提取采用水提醇沉法[11]。用超聲波破碎芽孢桿菌菌體后，在破碎菌液中加入10倍體積蒸餾水，95 ℃恒溫水煮2 h，然后收集離心(4 000 r/min, 10 min)后的上清液。加無水乙醇至上清液中，使乙醇終質(zhì)量分數(shù)達到95%，離心(2 000 r/min, 10 min)后取沉淀。并利用Savage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)去除沉淀中的蛋白層。收集去除蛋白層后的水相，通過冷凍干燥獲得胞內(nèi)多糖粗提物。

1.1.2 實驗用蝦及飼料 實驗用凡納濱對蝦購自山東省青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，體色和活力正常，初始體重為(0.88±0.04) g，體長為(4.19±0.06) cm。

以煙臺大樂凡納濱對蝦配合飼料為基礎飼料。飼料的主要營養(yǎng)成分包括：粗蛋白含量≥39%、粗脂肪≥4%、粗纖維≤6%、鈣≤5%、總磷≥1.2%、水分≤11.0%。將提取物用適量的水稀釋，采用噴淋攪拌的方式與配合飼料進行混勻，于30 ℃條件下干燥并保存至-20 ℃條件下備用。以上2種粗提物添加量均為1%，即每kg配合飼料添加10 g粗提物。

1.1.3 實驗條件 該實驗在室內(nèi)養(yǎng)殖水循環(huán)系統(tǒng)中進行。該水循環(huán)系統(tǒng)組成包括：玻璃缸(50 cm×35 cm×50 cm)、砂濾罐、紫外消毒器、泡沫分離器。整個養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件如下：水溫(26.00±1.00)℃，鹽度30.00±1.50，pH為7.7～8.1，DO≥6 mg/L。

1.2 實驗設計與管理

1.2.1 養(yǎng)殖實驗 實驗設置對照組(Blank)、胞外蛋白組(Ex-Pro)及胞內(nèi)多糖組(In-Poly)3個實驗組。每個實驗組設置4個平行組，每個平行15只對蝦。其中，對照組只投喂配合飼料；胞外蛋白組投喂含1%芽孢桿菌胞外蛋白粗提物的配合飼料；胞內(nèi)多糖組投喂含1%芽孢桿菌胞內(nèi)多糖粗提物的配合飼料。養(yǎng)殖期間每天投喂3餐，根據(jù)對蝦的生長及攝食情況合理調(diào)整投喂量，養(yǎng)殖實驗共持續(xù)28 d。

1.2.2 WSSV感染實驗 養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，凡納濱對蝦停食1 d，參照Feng[12]等的方法將各實驗組剩余的蝦進行WSSV注射感染實驗。該實驗所用WSSV由中國海洋大學水產(chǎn)動物病害與免疫學研究室提供，提取自感染W(wǎng)SSV病毒的中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)鰓組織。使用前用0.01 mol/L PBS稀釋1 000倍，在蝦腹部第四、五節(jié)之間注射，注射劑量為50 μL。觀察、統(tǒng)計各組凡納濱對蝦死亡數(shù)并計算累積死亡率。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 樣品采集與保存 于實驗第0天從所有實驗對蝦中隨機取3只對蝦，實驗過程中，分別在14和28 d隨機從各實驗組取3只對蝦，將對蝦肝胰腺、肌肉及腸道組織取出后放入超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品測定 準確稱取各組對蝦肝胰腺、肌肉及腸道組織0.2 g于預冷的生理鹽水(樣品質(zhì)量與生理鹽水體積比為1∶9)中充分勻漿，離心(2 500 r/min, 10 min)取上清液進行各指標的測定。肝胰腺及肌肉中能量代謝相關酶指標包括己糖激酶(HK)活力、磷酸果糖激酶(PFK)活力、丙酮酸激酶(PK)活力、乳酸脫氫酶(LDH)活力、琥珀酸脫氫酶(SDH)活力、脂肪酸合酶(FAS)含量，腸道消化酶指標包括蛋白酶活力、淀粉酶活力、脂肪酶活力。以上指標均使用南京建成試劑盒測定，具體操作按照相應試劑盒操作說明完成。

肝胰腺中電子傳遞系統(tǒng)(Electron Transport System, ETS)活力參考De Coen等[13]的方法進行測定，操作步驟為：將肝胰腺組織放入緩沖液(75 mmol/L MgSO4,1.5 g/L polyvinypyrrolidone, 0.2% Triton X-100 and 0.1 mol/L TriseHCl, pH=8.5)中勻漿后，離心(800g, 10 min)并取上清液50 μL加入到150 μL反應體系(1.7 mmol/L NADH, 0.25 mmol/L NADPH, 0.2% Triton X-100 and 0.1 mmol/L TriseHCl, pH=8.5)中。在體系中繼續(xù)加入100 μL p-Iodonitroterazolium，20 ℃下反應10 min，立即加入50 μL終止液(50%甲醛，50% 1 mol/L H3PO4)使反應終止，利用分光光度計測定體系最終吸光度OD490。通過ε=15 900/(mol·L-1)計算甲瓚的生成量，然后通過甲瓚的生成量換算成O2的消耗量(體系每生成2 mmol甲瓚消耗1 mmol O2)，以消耗的O2量表示ETS活力。

在養(yǎng)殖實驗結(jié)束后測量各組蝦的質(zhì)量，并計算其相對增重率(Weight gain rate, WGR)和特定生長率(Specific growth rate, SGR)，計算公式如下：

WGR=[(Wt-W0)/W0] ×100；

SGR(%·d-1)=[(lnWt-lnW0)/T] ×100。

式中：W0表示初始質(zhì)量(g)；Wt表示養(yǎng)殖結(jié)束后的質(zhì)量(g)；T表示間隔天數(shù)(d)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(Means±SD)表示，酶學測定時每個實驗處理重復3次(N=3)，對同一時間點不同實驗組的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，應用Duncan多重比較檢驗各組數(shù)據(jù)之間的差異性。通過軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，P<0.05即表示具有顯著差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對幼蝦生長性能的影響

養(yǎng)殖實驗結(jié)束時，各組凡納濱對蝦的終末體重、WGR、SGR和成活率如表1所示。在飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物后，凡納濱對蝦的體重、WGR、SGR及成活率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組凡納濱對蝦的終末體重、相對增重率、特定生長率及成活率Table 1 Final body weight, WGR, SGR, and survival rate of L. vannamei in different groups

2.2 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對幼蝦肝胰腺中能量代謝相關酶活力的影響

飼喂胞內(nèi)多糖粗提物使HK活力下降，且胞內(nèi)多糖組HK活力在養(yǎng)殖實驗前期顯著低于對照組(P<0.05)(見圖1A)。在養(yǎng)殖實驗前期，胞外蛋白組PFK活力顯著高于對照組(P<0.05)(見圖1B)，但實驗結(jié)束時，胞外蛋白組與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。各組凡納濱對蝦PK活力無顯著差異，但隨著養(yǎng)殖時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢(見圖1C)。

胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組LDH活力在養(yǎng)殖實驗前期顯著高于對照組(P<0.05)(見圖1D)。但在養(yǎng)殖實驗后期，胞外蛋白組與對照組無顯著差異(P>0.05)，而胞內(nèi)多糖組顯著低于對照組(P<0.05)。

胞外蛋白組SDH活力在養(yǎng)殖實驗前期與對照組無顯著差異(P>0.05)，但養(yǎng)殖實驗后期顯著高于對照組(P<0.05)(見圖1E)。飼喂胞內(nèi)多糖粗提物后，凡納濱對蝦SDH活力與對照組無顯著性差異及明顯變化規(guī)律(P>0.05)(見圖1E)。

飼喂胞外蛋白粗提物和胞內(nèi)多糖粗提物一段時間后，幼蝦FAS含量顯著低于對照組(P<0.05)(見圖1F)，但飼喂隨著時間的延長，各組之間FAS含量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對幼蝦肌肉中能量代謝相關酶活力的影響

胞外蛋白組的凡納濱對蝦在養(yǎng)殖實驗后期HK活力顯著高于對照組(P<0.05)(見圖2A)。胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組PFK活力在養(yǎng)殖實驗后期顯著低于對照組(P<0.05)(見圖2B)，且胞外蛋白粗提物的效果更加顯著。與對照組相比，飼喂胞外蛋白粗提物和胞內(nèi)多糖粗提物對PK活力無顯著影響(P>0.05)(見圖2C)，但在養(yǎng)殖實驗后期，胞外蛋白組顯著低于胞內(nèi)多糖組(P<0.05)。

飼喂2種不同粗提物對LDH活力均表現(xiàn)出顯著影響(P<0.05)(見圖2D)。其中，飼喂胞外蛋白粗提物后，凡納濱對蝦LDH活力顯著低于對照組(P<0.05)。胞內(nèi)多糖組LDH活力在養(yǎng)殖實驗前期與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，但隨著飼喂時間的延長，顯著低于對照組(P<0.05)。

SDH活力在養(yǎng)殖實驗后期受到2種不同粗提物的顯著影響(P<0.05)(見圖2E)，在養(yǎng)殖實驗后期，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組SDH活力均顯著高于對照組(P<0.05)。

在養(yǎng)殖實驗前期，飼喂胞外蛋白粗提物和胞內(nèi)多糖粗提物對FAS含量無顯著影響(P>0.05)(見圖2F)，但隨著飼喂時間的延長，在養(yǎng)殖實驗后期，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組FAS含量顯著低于對照組(P<0.05)，其中胞內(nèi)多糖組效果尤其顯著。

(同一時間點上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖1 各組凡納濱對蝦肝胰腺中己糖激酶(HK, A)、磷酸果糖激酶(PFK, B)、丙酮酸激酶(PK, C)、
乳酸脫氫酶(LDH, D)、琥珀酸脫氫酶(SDH, E)活性和脂肪酸合酶(FAS, F)含量的變化
Fig.1 Variations of hexokinase (HK, A), phosphofructokinase (PFK, B), pyruvate kinase (PK, C), lactate
dehydrogenase (LDH, D), and succinate dehydrogenase (SDH, E) activity and fatty acid
synthase (FAS, F) content in the hepatopancreas ofL.vannameiin different groups

2.4 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對幼蝦腸道消化酶活力的影響

胞外蛋白組蛋白酶活力高于對照組，且在養(yǎng)殖實驗前期達到顯著水平(P<0.05)(見圖3A)。在養(yǎng)殖實驗的14和28 d，胞內(nèi)多糖組蛋白酶活力均顯著高于對照組(P<0.05)(見圖3A)。飼喂胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對淀粉酶活力無顯著影響(P>0.05)(見圖3B)。脂肪酶活力受胞外蛋白粗提物的顯著影響(P<0.05)(見圖3C)，胞外蛋白組脂肪酶活力低于對照組，且在養(yǎng)殖實驗前期達到顯著水平(P<0.05)。

2.5 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對幼蝦肝胰腺中ETS活力的影響

飼喂胞外蛋白與胞內(nèi)多糖粗提物對ETS活力具有顯著影響(P<0.05)(見圖4)。胞外蛋白組與胞內(nèi)多糖組凡納濱對蝦ETS活力顯著高于對照組(P<0.05)，其中胞外蛋白粗提物的作用尤為顯著。

2.6 WSSV感染階段對蝦累積死亡率

感染W(wǎng)SSV后，對照組凡納濱對蝦累積死亡率高于胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組(見圖5)。對照組半致死時間LT50為42 h，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組凡納濱對蝦半致死時間LT50分別為53和45 h，相較于對照組分別延長了26.19%和7.14%。

3 討論

3.1 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對幼蝦生長的影響

芽孢桿菌是對蝦養(yǎng)殖過程中常用的益生菌，同樣也是飼料中主要益生菌添加種類。唐楊等研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)可提高凡納濱對蝦的生長速度[14]。但劉強強等將地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)添加至對蝦飼料中，發(fā)現(xiàn)其對凡納濱對蝦生長的促進作用不顯著[15]。此外，某些外源蛋白[16]和多糖[17]等飼料添加劑對對蝦生長、存活等方面的提高作用也已被證實。然而，本實驗發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白或胞內(nèi)多糖粗提物對促進幼蝦生長及提高成活率的效果并不顯著。

(同一時間點上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖2 各組凡納濱對蝦肌肉中己糖激酶(HK, A)、磷酸果糖激酶(PFK, B)、丙酮酸激酶(PK, C)、
乳酸脫氫酶(LDH, D)、琥珀酸脫氫酶(SDH, E)活性和脂肪酸合酶(FAS, F)含量的變化
Fig.2 Variations of hexokinase (HK, A), phosphofructokinase (PFK, B), pyruvate kinase (PK, C),
lactate dehydrogenase (LDH, D),and succinate dehydrogenase (SDH, E) activity and fatty acid synthase (FAS, F)
content in the muscle ofL.vannameiin different groups

3.2 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對幼蝦能量代謝相關酶的影響

HK、PK、PFK作為糖酵解途徑3個關鍵的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，其活力可反映機體糖酵解途徑的水平[18]。該實驗中發(fā)現(xiàn)，飼喂胞外蛋白粗提物一段時間后，肝胰腺中PFK活力有一定程度的提高，但在養(yǎng)殖實驗后期，胞外蛋白組肝胰腺及肌肉組織中糖酵解相關酶活力與對照組相比差異不顯著，甚至低于對照組。由以上結(jié)果推測飼喂胞外蛋白粗提物一定時間內(nèi)能夠刺激凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺糖酵解能力的增強。但隨著飼喂時間的延長，肝胰腺糖酵解途徑水平減弱。而飼喂胞內(nèi)多糖粗提物對肝胰腺和肌肉中HK、PK和PFK活力影響不顯著，表明胞內(nèi)多糖粗提物對其糖酵解能力無顯著影響。

LDH是葡萄糖的無氧分解酶，其作用是將糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸在無氧條件下還原成乳酸[19]。養(yǎng)殖實驗前期，胞外蛋白和胞內(nèi)多糖組肝胰腺和肌肉中LDH活力均高于對照組，而到了養(yǎng)殖實驗后期，與對照組之間無顯著差異甚至低于對照組。肌肉中LDH活性呈現(xiàn)出與肝胰腺中相似的變化規(guī)律，養(yǎng)殖實驗后期，胞外蛋白和胞內(nèi)多糖組幼蝦肌肉中LDH活力顯著低于對照組。該實驗結(jié)果表明胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物能夠在一定程度上加強幼蝦肝胰腺對糖類能源物質(zhì)的無氧代謝能力，但隨著飼喂時間延長，效果逐漸不明顯，甚至會減弱機體對糖類的無氧代謝能力。該結(jié)果與粗提物對糖酵解途徑的影響一致。

SDH是三羧酸循環(huán)的關鍵酶，可為真核細胞和多種原核細胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子[20]，其活力可在一定程度上反映糖類有氧代謝的水平[21]。該實驗發(fā)現(xiàn)，飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物能不同程度地提高凡納濱對蝦幼蝦機體SDH活力，相比較而言，胞外蛋白粗提物的效果更加明顯。SDH活力的提高表明飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物在一定程度上能提高糖類的有氧代謝水平，加快機體對糖類的轉(zhuǎn)化利用。

(同一時間點上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖3 各組凡納濱對蝦腸道中蛋白酶(Trypsase, A)、
淀粉酶(AMS, B)、脂肪酶(LPS, C)活性的變化
Fig.3 Variations of intestinal protease (A), amylase (B), and
lipase (C) activity ofL.vannameiin different groups

FAS是一種多酶復合體，在機體脂類代謝過程中具有重要作用[22]。FAS的多寡、活力的高低一定程度上可以反映動物機體脂質(zhì)代謝水平[23]。有研究表明，動物機體FAS含量受到碳水化合物[24]、蛋白質(zhì)[25]及脂肪酸[26]種類及含量等因素的影響。本實驗中，飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物一段時間后，幼蝦肝胰腺中FAS含量有所下降，肌肉中FAS含量無明顯變化。表明飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物對凡納濱對蝦幼蝦脂類代謝水平具有一定的抑制作用，且主要作用于肝胰腺中。但隨著飼喂時間的延長，各組幼蝦肝胰腺中FAS含量無顯著差異，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組肌肉中FAS含量顯著低于對照組，推測2種粗提物對脂類代謝的抑制作用逐漸轉(zhuǎn)移至肌肉組織中。其中的具體機制還有待進一步探討。

(同一時間點上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖4 各組凡納濱對蝦肝胰腺中電子傳遞系統(tǒng)(ETS)活性的變化
Fig.4 Variations of ETS activity in the hepatopancreas
ofL.vannameiin different groups

圖5 感染W(wǎng)SSV后凡納濱對蝦的累積死亡率Fig. 5 Cumulative mortality rate of L. vannamei in different groups during the WSSV infection period

3.3 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對幼蝦腸道消化酶的影響

動物的消化器官對飼料的組成具有較強的敏感性，飼料的組成能調(diào)節(jié)消化酶活力，進而對動物的其它生理狀態(tài)造成影響[27]。Ziaei-Nejad等發(fā)現(xiàn)，在對蝦飼料中添加芽孢桿菌能夠提高對蝦腸道消化酶活力[28]。胡毅等也發(fā)現(xiàn)在飼料中添加益生菌能夠提高對蝦腸道蛋白酶和淀粉酶活力，并推測消化酶活力的提高可能會促進對蝦的生長[29]。該實驗中發(fā)現(xiàn)飼喂芽孢桿菌2種粗提物后，蛋白酶活力均顯著提高，表明2種粗提物均會增強凡納濱對蝦幼蝦腸道對蛋白質(zhì)營養(yǎng)的吸收。除此之外，還發(fā)現(xiàn)胞外蛋白組的脂肪酶活力顯著低于對照組，表明胞外蛋白粗提物降低了幼蝦對脂肪營養(yǎng)的吸收利用，這可能與上述胞外蛋白組對蝦肝胰腺及肌肉組織中FAS含量的較低有一定關系。

3.4 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對幼蝦肝胰腺ETS活力的影響

ETS可將電子從待氧化的底物逐級傳遞到分子氧，同時釋放能量，其活力可用以反應機體的代謝水平[30]。該實驗中，飼料中添加2種粗提物后可以有效提高幼蝦肝胰腺中的ETS活力，表明胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物能夠提高凡納濱對蝦幼蝦機體的整體代謝水平。結(jié)合上述機體能量代謝相關酶結(jié)果分析，糖類有氧代謝水平的提高可能是ETS活力增強的原因之一。

3.5 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對幼蝦抗WSSV能力的影響

芽孢桿菌作為一類在對蝦養(yǎng)殖中廣泛應用的益生菌，已有研究證明其中的某些菌株能夠提高對蝦抗WSSV能力[31]。此外，已有報道稱蛋白[32]、多糖[33]等功能性飼料添加劑能夠起到相似的作用。該實驗所選取的芽孢桿菌BZ5株已在前期研究中證明了其能夠提高凡納濱對蝦抗WSSV能力[9, 34]。該實驗再次證明了該芽孢桿菌的胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物能夠在一定程度延長WSSV感染后的LT50。其中，胞外蛋白粗提物的作用尤其明顯。因此推測胞外蛋白和胞內(nèi)多糖可能是該菌株提高凡納濱對蝦抗WSSV能力的功能組分。

學者們通常是從提高機體免疫能力的角度解釋對蝦抗病能力提高的原因。然而，已有研究表明對蝦在提高機體免疫應答水平的同時會大量消耗能量[35-36]，因此能量代謝水平與凡納濱對蝦抗病原感染能力密切相關。該實驗發(fā)現(xiàn)飼喂2種粗提物提高了幼蝦機體代謝水平，尤其是糖類的有氧代謝水平。幼蝦感染W(wǎng)SSV后，能源物質(zhì)能夠快速動員以抵抗病原感染，因此可能是對蝦感染W(wǎng)SSV后LT50延長的原因之一。而且，胞外蛋白粗提物對糖類代謝水平的提高作用較胞內(nèi)多糖粗提物更加顯著，這可能是胞外蛋白組幼蝦LT50明顯長于胞內(nèi)多糖組的原因。

此外，F(xiàn)AS在動物抗菌及抗病毒免疫中的作用也逐漸被研究者證明。Yang等研究表明，WSSV會誘導對蝦FAS表達增加，改變宿主體內(nèi)的脂類代謝平衡，直接影響病毒組裝[37]。Hsieh等發(fā)現(xiàn)，在FAS抑制劑存在的條件下，WSSV病毒體的形成受損[38]。該實驗中發(fā)現(xiàn)飼喂胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物使幼蝦FAS含量下降，一定程度上可能會提高其抗WSSV感染死亡能力。

4 結(jié)語

在飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對凡納濱對蝦幼蝦生長無顯著性影響，但一定程度上影響了機體能量代謝水平和腸道消化酶活力。其對幼蝦能量代謝的影響具體表現(xiàn)在提高了糖類的有氧代謝水平，抑制了脂類代謝水平。2種粗提物對凡納濱對蝦幼蝦抗WSSV能力均有不同程度的提高，通過結(jié)果分析，推測這種抗病能力的提高與其對蝦的能量代謝水平的影響密切相關。