張俊彪，崔廣同，蔡春芳，任勝杰，倪 沁，王承睿，李文健，葛逸揚(yáng)，丁惠明，張 鋮

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215123；2.蘇州市陽澄湖國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司，江蘇蘇州 215123)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis，簡(jiǎn)稱河蟹)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，脫殼是其實(shí)現(xiàn)個(gè)體增長(zhǎng)的必由途徑，也是影響其存活率的重要環(huán)節(jié)。養(yǎng)殖過程中為促進(jìn)河蟹順利脫殼，蟹塘通常栽種大量水草供其藏身?xiàng)?。然而，在相?duì)較小且封閉的池塘環(huán)境中，水草的光合作用和呼吸作用及微生物發(fā)酵常常導(dǎo)致水體pH劇烈變化。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，晴天時(shí)大多蟹塘pH高于9.4，pH最高的可達(dá)10.3以上，也有少量蟹塘因水草衰敗腐爛等原因使水體pH降至3.0以下。大量研究表明異常酸、堿環(huán)境會(huì)造成水生動(dòng)物鰓組織損傷[1]，改變其能量代謝方式[2]，并可能影響其正常脫殼[3]和生長(zhǎng)[4,5]。河蟹在酸、堿脅迫時(shí)也呈現(xiàn)相似的生理響應(yīng)[2,6]，但尚無關(guān)于極端異常酸、堿脅迫對(duì)河蟹生理和生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察短期極端酸、堿脅迫對(duì)河蟹血清生化、抗氧化力、組織損傷、后續(xù)脫殼增長(zhǎng)率和存活率的影響，旨在揭示短期酸、堿脅迫的危害，繼而為優(yōu)化養(yǎng)殖管理技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究包含兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一重點(diǎn)研究短期酸、堿脅迫對(duì)河蟹成蟹生理的影響，實(shí)驗(yàn)二重點(diǎn)探究短期酸、堿脅迫對(duì)河蟹幼蟹脫殼增長(zhǎng)率和存活率的影響。

1.2 短期酸、堿脅迫對(duì)河蟹成蟹生理的影響

1.2.1 飼養(yǎng)管理及樣品制備

實(shí)驗(yàn)在蘇州市陽澄湖國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范區(qū)發(fā)展有限公司研究生工作站進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)蟹購自本地蟹苗養(yǎng)殖場(chǎng)，在室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)15 d，期間投喂河蟹商品飼料。每天7∶30和18∶30各飽食投飼一次。暫養(yǎng)結(jié)束后禁食24 h，選取225只規(guī)格整齊、附肢齊全的河蟹，隨機(jī)分入9個(gè)體積為400 L的圓形塑料缸內(nèi)飼養(yǎng)，缸內(nèi)盛有pH分別為3.0(酸脅迫組)、7.5(對(duì)照組)和10.3(堿脅迫組)的水250 L，每缸放養(yǎng)25只，三個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)蟹的體均重為(50.4±2.5) g。以PVC網(wǎng)片作為河蟹的攀爬物和隱蔽物。實(shí)驗(yàn)期間每3 d吸污1次并換水1/3。養(yǎng)殖用水為經(jīng)沉淀至少48 h的陽澄湖水。于投飼后0.5 h監(jiān)測(cè)、并調(diào)整pH兩次。每天收集死蟹并稱重、記錄。實(shí)驗(yàn)期間水溫20～24 ℃，24 h持續(xù)增氧，水體溶氧不低于6.7 mg/L。

1.2.2 血清生化分析

分別于脅迫前(0 h)和脅迫后6 h、12 h、1 d、3 d和5 d，及恢復(fù)2 d、6 d和15 d時(shí)采樣。采樣時(shí)，隨機(jī)從每缸取3只河蟹，用1 mL一次性注射器從第4步足基關(guān)節(jié)處抽取血淋巴并轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min收集血清。血清乳酸脫氫酶活性(LDH，U/L)及血糖濃度(GLU，mmol/L)、總蛋白濃度(TP，g/L)和尿素濃度(Urea，mmol/L)采用寧波美康生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)。血清總超氧化物歧化酶活性(T-SOD，U/mg prot)和總抗氧化力(T-AOC，U/mg prot)采用南京建城生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。血清生化指標(biāo)均采用全自動(dòng)生化分析儀(C8000，Abbott Laboratories，USA)測(cè)定。

1.2.3 鰓組織碳酸酐酶(CA)和Na+-K+-ATPase(NAK)活力測(cè)定

脅迫5 d時(shí)每缸隨機(jī)取3只河蟹，在冰盤上麻醉后解剖取鰓組織，用4 ℃預(yù)冷的PBS沖洗并液氮速凍保存。測(cè)定前于冰浴中充分勻漿后，5 000 r/min離心15 min，取上清，用上海優(yōu)選生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定。

1.2.4 肝胰腺和肌肉糖原含量測(cè)定

脅迫5 d和恢復(fù)15 d時(shí)從每缸分別隨機(jī)取3只河蟹，冰浴麻醉后解剖取肝胰腺和肌肉組織，用4 ℃預(yù)冷的PBS沖洗并液氮速凍，用30% NaOH沸水浴20 min充分水解，采用南京建城生物工程有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定其糖原含量。

1.2.5 組織切片

脅迫5 d時(shí)從每缸隨機(jī)取3只河蟹，冰浴麻醉后解剖取肝胰腺和鰓組織，用4 ℃預(yù)冷的PBS沖洗后放入4%甲醛溶液固定24 h后，按常規(guī)石蠟組織切片制作程序進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度5 μm，經(jīng)HE染色后分片。用顯微成像系統(tǒng)(AXoskop顯微鏡，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany；彩色攝像機(jī)，VCKY-F30，Tokyo，Japan)觀察并采集組織切片照片。

1.3 短期酸、堿脅迫對(duì)河蟹幼蟹生長(zhǎng)和脫殼的影響

實(shí)驗(yàn)蟹[初重為(0.87±0.21)g]來源、馴化及飼養(yǎng)管理方式同前。選取450只規(guī)格整齊、附肢齊全的河蟹隨機(jī)分養(yǎng)于9個(gè)體積為400 L的圓形塑料缸內(nèi)(盛水約150 L)，每缸放養(yǎng)50只。用1 mol/L HCl和NaOH分別將缸內(nèi)的水于10 h內(nèi)逐漸調(diào)至pH 3.0、pH 7.5和 pH 10.3，每個(gè)處理三個(gè)平行，隨機(jī)分配。脅迫5 d后于10 h內(nèi)將酸、堿性的水逐漸換成pH 7.5的對(duì)照用水繼續(xù)飼養(yǎng)。每天收集死蟹及殘餌并稱重、記錄，收集脫下的頭胸甲并測(cè)定殼寬、殼長(zhǎng)和脫殼日期。期間水溫為18～23 ℃。飼養(yǎng)4周后，禁食24 h，稱每缸蟹的總重并計(jì)數(shù)。成活率、平均增重率、脫殼增長(zhǎng)率和脫殼周期的計(jì)算公式如下：

成活率=Nf/Ni×100%；

脫殼增長(zhǎng)率=(La-Lb)/Lb×100%；

個(gè)體增重率=(Wf-Wi)/Wi×100%；

脫殼周期=第二次脫殼日期-第一次脫殼日期。

注：Ni為飼養(yǎng)開始時(shí)每缸放養(yǎng)的蟹只數(shù)；Nf為飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)每缸存活的蟹只數(shù)；La為脫殼后頭胸甲寬(mm)；Lb為脫殼前頭胸甲寬(mm)；Wf為平均末重(g/crab)；Wi為平均初重(g/crab)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各處理間的差異采用單因子方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時(shí)再進(jìn)行Duncan’s多重比較；兩個(gè)處理間進(jìn)行比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t-檢測(cè)，P<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS 22.0。

2 結(jié)果

2.1 酸、堿脅迫對(duì)河蟹生理的影響

由圖1可知，酸、堿脅迫后6 h和12 h血清LDH活力均顯著高于對(duì)照組，3 d時(shí)均顯著低于對(duì)照組，酸脅迫的變化幅度更大。脅迫5 d時(shí)各組間差異不顯著，但此時(shí)酸脅迫組河蟹全部死亡?；謴?fù)期堿脅迫組與對(duì)照組差異均不顯著。酸脅迫后GLU劇烈升高，于12 h到達(dá)峰值，此時(shí)GLU比對(duì)照組高約14倍，脅迫5 d時(shí)GLU也顯著高于對(duì)照組，其余時(shí)刻差異不顯著。堿脅迫6 h和12 h時(shí)GLU也高于對(duì)照組但差異不顯著，最高值為對(duì)照組的2.7倍，恢復(fù)期堿脅迫組與對(duì)照組差異不顯著。酸脅迫24 h血清尿素含量顯著低于對(duì)照組，其余時(shí)刻及堿脅迫組血清尿素含量和對(duì)照組無顯著差異。酸脅迫6 h和24 h血清TP顯著高于對(duì)照組，堿脅迫24 h血清TP也顯著高于對(duì)照組，恢復(fù)6 d時(shí)觀察到堿脅迫組顯著高于對(duì)照組，其余時(shí)刻差異不顯著。

圖1 酸、堿脅迫對(duì)河蟹LDH活力、GLU、Urea及TP濃度的影響Fig.1 Effects of acid and alkali exposure on serum activity of LDH，GLU，Urea and TP of E.sinensis同一時(shí)刻柱上小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)，n=3。圖2同。

由圖2可知，酸、堿脅迫12 h和24 h血清T-AOC活力顯著高于對(duì)照組。堿脅迫6 h 和5 d時(shí)血清T-AOC顯著高于對(duì)照組而酸脅迫組低于對(duì)照組。恢復(fù)期堿脅迫組與對(duì)照組差異不顯著。酸脅迫3 d時(shí)血清T-SOD顯著高于堿脅迫組，但酸、堿脅迫后T-SOD與對(duì)照組的差異均不顯著。

由表1可知，與對(duì)照組相比，酸、堿脅迫5 d肝糖原顯著下降，而肌糖原變化不顯著?；謴?fù)15 d后堿脅迫組肝糖原含量仍顯著低于對(duì)照組。酸脅迫5 d后鰓NAK酶活力顯著低于堿脅迫和對(duì)照組，堿脅迫和對(duì)照組間差異不顯著。各處理間CA差異不顯著。

圖2 酸、堿脅迫對(duì)河蟹血清T-AOC和T-SOD活力的影響Fig.2 Effects of acid and alkali exposure on serum T-AOC and T-SOD of E.sinensis

表1 酸、堿脅迫對(duì)河蟹肝胰腺和肌肉糖原含量及CA和NAK活力的影響Tab.1 Effects of acid and alkali exposure on glycogen content of hepatopancreas and muscle and enzyme activity of CA and NAK in gill of E.sinensis

由圖3可知，與對(duì)照組相比，酸、堿脅迫5 d時(shí)均使肝小管基底膜與上皮細(xì)胞發(fā)生脫離，且酸脅迫時(shí)脫離更嚴(yán)重。由圖4可知，與對(duì)照組相比，酸、堿脅迫5 d時(shí)均使鰓小片變形、斷裂。

2.2 酸、堿脅迫對(duì)河蟹后續(xù)生長(zhǎng)及脫殼的影響

同對(duì)照組相比，酸、堿脅迫5 d均顯著降低了河蟹成活率，且酸脅迫組成活率顯著低于堿脅迫組(表2)。酸脅迫顯著縮短脫殼周期，降低脫殼增長(zhǎng)率；相應(yīng)地，脫殼次數(shù)增加，平均增重率顯著高于堿脅迫組和對(duì)照組。堿脅迫組脫殼增長(zhǎng)率和脫殼周期低于對(duì)照組但差異不顯著。

圖3 河蟹酸、堿脅迫5 d后肝胰腺形態(tài)結(jié)構(gòu)(H.E.)Fig.3 Hepatopancreas morphology of E.sinensis after acid and alkali exposure for 5 days(H.E.)A：pH 7.5(對(duì)照)，示基底膜緊貼肝小管，未見脫落；B：pH 3.0，基底膜與上皮分離；C：pH 10 .3，基底膜與上皮分離。BL：基底膜。

圖4 河蟹酸、堿脅迫5 d后鰓小片形態(tài)結(jié)構(gòu)(H.E.)Fig.4 Gill lamellae morphology of E.sinensis after acid and alkali exposure for 5 days(H.E.)A：pH 7.5(對(duì)照組)，示正常鰓小片結(jié)構(gòu)；B：pH 3.0(酸脅迫組)，示鰓小片結(jié)構(gòu)變形；C：pH 10.3(堿脅迫組)，示鰓小片變形、腫脹；PC：柱狀細(xì)胞。

表2 5 d酸、堿脅迫對(duì)河蟹存活率和脫殼增長(zhǎng)率的影響Tab.2 Effects on survival rate and moulting length increase rate of E.sinensis after acid and alkali exposure for 5 days

3 討論

酸、堿脅迫會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過量的氧自由基[7]，為了清除自由基以消減氧化損傷，機(jī)體會(huì)提高T-AOC和T-SOD活力[8]。本研究結(jié)果表明，酸、堿脅迫后6 h和24 h血清T-AOC活力顯著升高(圖2)，提示此時(shí)機(jī)體具有對(duì)酸、堿脅迫的正常應(yīng)答能力。然而，酸脅迫3 d和5 d時(shí)T-AOC低于對(duì)照組，這可能是由于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激導(dǎo)致代償功能的喪失[9]。從T-SOD來看，酸脅迫后6 h和12 h 時(shí)也有所升高，與T-AOC的結(jié)果一致。然而，堿脅迫后T-SOD活力低于對(duì)照組，盡管差異不顯著。存活率等其它指標(biāo)表明，堿脅迫引起的應(yīng)激反應(yīng)要比酸脅迫弱，損傷小，因此，T-SOD下降不大可能是由于免疫疲勞或者代償功能喪失。在中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)上也觀察到堿脅迫后T-SOD下降[10]。甲殼動(dòng)物應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的機(jī)制可能與其它動(dòng)物有所不同，其體內(nèi)富含蝦青素，蝦青素是一種高效抗氧化劑[11]，堿脅迫可能促進(jìn)河蟹調(diào)用蝦青素抗氧化[7]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，pH 10.3和pH 3.0的池塘內(nèi)河蟹體色均較淺甚至略顯紅色，可能與甲殼中結(jié)合態(tài)蝦青素釋放用于抗氧化有關(guān)。

動(dòng)物在應(yīng)激時(shí)往往有氧呼吸受到抑制，機(jī)體為了應(yīng)對(duì)外界刺激，激活無氧呼吸通路關(guān)鍵酶，增強(qiáng)糖酵解產(chǎn)能[8,16]。本研究中血清生化分析結(jié)果表明，酸、堿脅迫6 h和12 h后均增加了血清LDH活力和GLU[17]含量(圖1)，其中酸脅迫12 h時(shí)血清GLU是對(duì)照組的14倍，同時(shí)，脅迫5 d時(shí)肝糖原含量顯著下降，這一結(jié)果與已有報(bào)道一致[8]。比較酸、堿脅迫后肝糖原和肌糖原的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)肌糖原與對(duì)照組差異不顯著，而肝糖原在脅迫時(shí)顯著下降，表明急性脅迫時(shí)河蟹趨向于利用肝糖原而非肌糖原。

酸、堿脅迫增加了血清TP含量，尤其是酸脅迫時(shí)，但血清尿素含量未見顯著增加。這一現(xiàn)象與賈小燕[18]等在河蟹鹽度脅迫時(shí)觀察到的現(xiàn)象一致，提示應(yīng)激反應(yīng)時(shí)河蟹可能主要不是依靠分解蛋白供能[19]。TP升高可能主要是為了滿足滲透壓調(diào)節(jié)[20]和維持離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[21]以適應(yīng)異常環(huán)境。

蟹塘pH主要受水草盛衰的影響，多年調(diào)研中未見蟹塘pH持續(xù)處于極端狀態(tài)。盡管這種極端pH異常的持續(xù)時(shí)間較短，但研究中仍發(fā)現(xiàn)，pH連續(xù)5 d為10.3的蟹塘，后續(xù)脫殼期草叢中出現(xiàn)了不少脫殼不遂的死蟹，且活蟹體色及肝胰腺顏色普遍較淺。而在水體pH為3.0的苗種池塘中，蟹的體色和鰓均有發(fā)紅現(xiàn)象。由此推測(cè)，短期極端酸、堿脅迫可能會(huì)引起組織損傷，這種短期強(qiáng)脅迫很可能是養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中河蟹存活率低的重要原因。從組織形態(tài)看，酸、堿脅迫5 d后均出現(xiàn)鰓小片損傷變形(圖4B和4C)，肝胰腺基底層與上皮分離(圖3B和3C)，證明短期極端酸、堿脅迫均引起了河蟹鰓和肝胰腺組織損傷。從肝胰腺組織切片看，酸脅迫引起的組織損傷明顯強(qiáng)于堿脅迫(圖3B和3C)，與上述抗氧化力和血清生化分析結(jié)果相同，也與大多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[16,22]。

本研究結(jié)果表明，酸、堿脅迫會(huì)導(dǎo)致河蟹應(yīng)激脫殼，使脫殼周期縮短，平均個(gè)體增重率短期內(nèi)有所升高。這一現(xiàn)象與日本對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)[23]和斑節(jié)對(duì)蝦(P.monodon)[24]相似。但處于脅迫環(huán)境下通常會(huì)有更多的能量被用于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[25]，從而導(dǎo)致飼料利用效率低下，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[22]。本研究結(jié)果也表明酸、堿脅迫均顯著降低了河蟹成活率和脫殼增長(zhǎng)率。蟹塘內(nèi)水草的有無及其狀態(tài)被認(rèn)為是影響河蟹產(chǎn)量和規(guī)格的決定因素。本研究結(jié)果清楚地表明，短期極端酸、堿脅迫是影響河蟹存活率和脫殼增長(zhǎng)率的重要原因。蟹塘中酸脅迫比較少見，但短期pH大于10的池塘比比皆是。為了提高存活率和脫殼增長(zhǎng)率，從而提高產(chǎn)量，養(yǎng)殖過程中要注意對(duì)pH的管控。