容夢(mèng)婕，喀迪爾丁·艾爾肯，張文潤(rùn)，郝翠蘭，穆妮熱·喀迪爾，田勝利，岳 城

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

葉爾羌河位于新疆西南部，發(fā)源于喀喇昆侖山脈北麓，是我國(guó)最大的內(nèi)陸河—塔里木河的重要源流之一。該河的發(fā)育形成、地理地貌特點(diǎn)以及上游水系的特殊自然環(huán)境，使得該河孕育有一些特殊的土著魚類資源，包括裂腹魚亞科(Schizothoracinae)及鰍科高原鰍屬(Triplophysa)[1]魚類。斑重唇魚(Diptychusmaculates)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科，在我國(guó)主要分布于新疆天山以南的塔里木河水系和天山以北的伊犁河流域各水系[2-3]。近年來(lái)，由于人為因素的干擾，斑重唇魚的分布區(qū)域正在逐漸縮小，種群數(shù)量逐漸下降，現(xiàn)已被列為新疆維吾爾自治區(qū)II級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物[4]。為了保護(hù)斑重唇魚類資源，牛建功等[5]研究了斑重唇魚在人工條件下馴化養(yǎng)殖、繁育和增殖放流等技術(shù)，以達(dá)到物種保護(hù)、生態(tài)修復(fù)和恢復(fù)種群數(shù)量的效果。此外，相關(guān)學(xué)者對(duì)該流域斑重唇魚的研究多集中于野外資源調(diào)查和種群進(jìn)化等研究[6-9]，對(duì)危害其種群健康的寄生蟲病原報(bào)道較少。

指環(huán)蟲(Dactylogyrus)是單殖吸蟲種類中最為豐富的一個(gè)類群，其宿主種類多達(dá)28科194屬，主要寄生于鯉科魚類的鰓部[10]，表現(xiàn)出極強(qiáng)的宿主特異性。目前，由于仍有許多鯉科魚類尚未進(jìn)行全面調(diào)查，有學(xué)者認(rèn)為還存在大量的指環(huán)蟲新種有待發(fā)現(xiàn)、命名和描述[11]。據(jù)報(bào)道，寄生于裂腹魚亞科魚類的指環(huán)蟲全球約有16種[12-13]，在我國(guó)被記錄的有8種指環(huán)蟲，其中寄生于斑重唇的指環(huán)蟲僅有一種，為喀迪爾丁等[14]在新疆伊犁河流域采集的重唇魚指環(huán)蟲(Dactylogyrusdiptychus)。本課題組于2019年5月-2020年7月進(jìn)行葉爾羌河魚類寄生蟲區(qū)系調(diào)查時(shí)，在斑重唇魚鰓部采獲1種指環(huán)蟲，與伊犁河流域發(fā)現(xiàn)的重唇魚指環(huán)蟲存在較大形態(tài)差異。經(jīng)資料檢索該種在我國(guó)未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，明確該指環(huán)蟲種類，豐富葉爾羌河魚類寄生蟲病原體的種類組成，補(bǔ)充我國(guó)單殖吸蟲名錄，同時(shí)補(bǔ)充該指環(huán)蟲的分子數(shù)據(jù)，為該蟲在分子系統(tǒng)進(jìn)化方面積累資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的來(lái)源與處理

2019年5月-2020年7月在葉爾羌河流域的塔什庫(kù)爾干河段(37°46′ N，75°13′ E)共采集斑重唇魚272尾。對(duì)新鮮的魚類標(biāo)本進(jìn)行拍照、編號(hào)、稱重和測(cè)量，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。魚類解剖及寄生蟲采集主要參照《魚病調(diào)查手冊(cè)》[15]。將宿主鰓片逐一取下后，滴加少量生理鹽水置載玻片上，用解剖針輕輕刮取粘液，并在解剖鏡下逐一檢查，挑取蟲體。發(fā)現(xiàn)蟲體后將其吸取到盛有清水的小皿中，沖洗干凈，置于1.5 mL的EP管中，滴加75%和95%濃度的酒精固定。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

在解剖鏡下挑取形態(tài)完整的12只蟲體逐一放置在載玻片上，用4% PVL(聚乙烯醇-乳酸酚染液)固定封片。在光學(xué)顯微鏡(Nikon E2000)下觀察，通過(guò)EZ-MET軟件測(cè)量后吸器及交接器中的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)。利用t檢驗(yàn)比較測(cè)量結(jié)果平均數(shù)的差異是否顯著。測(cè)量拍照后在硫酸紙上繪制特征圖，并依據(jù)文獻(xiàn)[12，13]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。所制蟲體標(biāo)本保存在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲教研室。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

取95%乙醇固定的蟲體樣本置于TE Buffer(pH 8.0)中浸泡過(guò)夜后，將蟲體分別裝入1.5 mL的EP管中，用Trans Gen動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取蟲體DNA(具體操作方法依照試劑盒說(shuō)明書)。

選取18S-ITS1-5.8S rDNA序列作為目的序列，擴(kuò)增引物分別參照imková等[16]，上游引物S1：5′-ATTCCGATAACGAACGAGACT-3′，下游引物IR8：5′-GCTAGCTGCGTTCTTCATCGA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：2 × Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，1 pmol/μL上下游引物各1 μL，10 ng/μL的模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。同時(shí)，以雙蒸水代替模板DNA作為陰性對(duì)照。優(yōu)化選取的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，92 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余20 μL PCR產(chǎn)物跑膠后，切取目的條帶，并用Trans Gen Biotech(全氏金)膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli) DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，LB平板培養(yǎng)，經(jīng)PCR檢測(cè)后每個(gè)樣品選取2個(gè)陽(yáng)性克隆送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果用 SeqMan 軟件進(jìn)行校對(duì)和編輯，在DNAMAN 7.0軟件中進(jìn)行序列比對(duì)，計(jì)算序列間的差異百分比?；贙imura雙參數(shù)模型，采用MEGA 7.0和BLAST計(jì)算所測(cè)序列之間的A、T、G、C的平均含量、堿基變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等信息，并計(jì)算遺傳距離。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與所得序列相似度較高的20種指環(huán)蟲18S-ITS1-5.8S rDNA序列，以幾丁嗜麗魚蟲(Cichlidogyrussclerosus)為外類群，一起導(dǎo)入 Phylosuite[17]軟件中，進(jìn)行貝葉斯法(Bayesian Inference，BI)建樹(shù)和最大似然法(Maximum Likelihood，ML)建樹(shù)。運(yùn)用Model Finder進(jìn)行模型計(jì)算，以AIC為標(biāo)準(zhǔn)篩選出ML樹(shù)和BI樹(shù)的最佳替換模型分別為TIM3+F+I+G4和GTR+F+I+G4。用 PhyloSuite 中自帶的IQ tree和Mr Bayes軟件建立ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。其中BI樹(shù)共運(yùn)算6 000 000代蒙特卡羅模擬(Markov chain Monte Crlo；MCMC)，每100代取樣1次，共進(jìn)行兩次重復(fù)，用后驗(yàn)概率來(lái)表示各節(jié)點(diǎn)的置信度。利用IQ tree 2版本[18]中的近似無(wú)偏檢驗(yàn)(AU檢驗(yàn))ML和BI方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)錁?gòu)形差異是否具有統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果

對(duì)272尾斑重唇魚進(jìn)行剖檢，共收集蟲體2 995只。通過(guò)種類鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑重唇魚僅感染了一種指環(huán)蟲，總感染率為70.2%，平均感染強(qiáng)度為15.68 ± 1.88，最高感染強(qiáng)度為189。

2.1 蟲體的形態(tài)學(xué)特征

基于12個(gè)封片標(biāo)本，蟲體呈柳葉狀，為小型單殖吸蟲，體長(zhǎng)394(308 ～ 471) μm，體最大寬89(79 ～ 103) μm。眼點(diǎn)兩對(duì)，咽近乎呈圓形，大小48(39 ～ 58) μm× 49(40 ～ 58) μm。后吸器位于體后端，類橢圓形，長(zhǎng)69(64 ～ 76) μm，寬103(94 ～ 126) μm，包含1對(duì)中央大鉤、1個(gè)聯(lián)結(jié)片、7對(duì)邊緣小鉤。邊緣小鉤發(fā)育良好，可明顯區(qū)分鉤尖、鉤柄和柄軸3部分，其中柄軸短而粗壯。7對(duì)幾乎等大，全長(zhǎng)23(19 ～ 24) μm，鉤尖長(zhǎng)5(4 ～ 6) μm，鉤柄長(zhǎng)8(7 ～ 9) μm，柄軸長(zhǎng)9(7 ～ 10) μm。中央大鉤基部較短，有長(zhǎng)而彎曲的鉤尖，全長(zhǎng)61(56 ～ 68) μm，基部長(zhǎng)40(37 ～ 45) μm，鉤尖長(zhǎng)25(22 ～ 28) μm，內(nèi)外突明顯分葉，且內(nèi)突遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外突，長(zhǎng)26(23 ～ 28) μm，外突長(zhǎng)2(1 ～ 3) μm。聯(lián)結(jié)片呈粗壯“一”字型，兩端向上微翹且圓鈍，中央略“凸”，大小4(3 ～ 5) μm× 43(40 ～ 48) μm。

交接器由交接管和支持器組成，交接管呈現(xiàn)出明顯的中空管狀結(jié)構(gòu)，基部膨大，并被形似“煙斗”狀的基質(zhì)包裹，逐漸延伸膨大，末端形成喇叭狀，管長(zhǎng)42(38 ～ 45) μm。支持器與交接管基部相連，其結(jié)構(gòu)如同俄文字母“Г”，末端呈指狀彎曲并附著一個(gè)弧形突起，支持器長(zhǎng)38(37 ～ 42) μm。陰道和卵未見(jiàn)。

圖1 單式指環(huán)蟲整蟲(A)；后吸器(B、D)；交接器(C、E)Fig.1 Total view of Dactylogyrus simplex (A)；Haptor (B and D)；Copulatory organ (C and E) A、B、C：顯微結(jié)構(gòu)圖；D、E：手繪圖，比例尺=10 μm

2.2 蟲體的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

擴(kuò)增獲得的指環(huán)蟲rDNA片段進(jìn)行校正后，最終長(zhǎng)度為951 bp，包含18S和5.8S的部分序列(長(zhǎng)度分別為514 bp和27 bp)以及ITS1區(qū)域的完整序列(長(zhǎng)度為410 bp)。其中保守位點(diǎn)499個(gè)，變異位點(diǎn)515個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)438個(gè)，以及73個(gè)自裔位點(diǎn)。A、T、G、C堿基的平均含量為23.5%、27.8%、26.5%、22.2%，A+T的含量高于G+C的含量。選取2個(gè)蟲體的18S-ITS1-5.8S rDNA 序列(兩序列的一致性為100%)，上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MT476980-MT476981。

ML法和BI法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)經(jīng)AU檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因而，選取BI樹(shù)(同時(shí)標(biāo)注ML分析的分支支持率)作為代表，用來(lái)說(shuō)明系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分為兩個(gè)大的進(jìn)化支，其中斑重唇魚上的重唇魚指環(huán)蟲與隱藏指環(huán)蟲(D.cryptomeres)、具鱗指環(huán)蟲(D.squameus)和頁(yè)形指環(huán)蟲(D.lamellatus)親緣關(guān)系較近，聚為穩(wěn)定的獨(dú)立分支。而單式指環(huán)蟲與鯽寄生的美麗指環(huán)蟲(D.formosus)、錨鉤指環(huán)蟲(D.anchoratus)及弧形指環(huán)蟲組成的分枝互為姊妹枝，且位于另一分支上。

圖2 基于 18S-ITS1-5.8S rDNA 序列構(gòu)建的鯉科魚類寄生指環(huán)蟲貝葉斯法(BI)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Dactylogyrus based on 18S-ITS1-5.8S rDNA sequences based on the Bayesian Inferences (BI) method分支節(jié)點(diǎn)數(shù)值分別表示BI和ML的分支自展檢驗(yàn)支持率

3 討論

我國(guó)指環(huán)蟲種類多樣，約占世界的40%，這與指環(huán)蟲強(qiáng)烈的宿主特異性密切相關(guān)[19]。通常情況下，指環(huán)蟲可以根據(jù)宿主種類，進(jìn)行初步的鑒定。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，寄生于斑重唇魚的指環(huán)蟲有3種，分別為單式指環(huán)蟲(D.simplex)、D.drjagini和重唇魚指環(huán)蟲(D.diptychus)[12,14]，故將葉爾羌河斑重唇魚鰓上檢獲的指環(huán)蟲與這3種指環(huán)蟲進(jìn)行了形態(tài)及測(cè)量值的比較。

本種與D.drjagini和重唇魚指環(huán)蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，不管是在交接器還是后吸器的形態(tài)上都明顯存在不同(圖3)，主要體現(xiàn)在：本種中央大鉤內(nèi)外突明顯分葉，且內(nèi)突遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外突，鉤尖較長(zhǎng)，而重唇魚指環(huán)蟲中央大鉤內(nèi)外突分葉不明顯，D.drjagini的雖明顯分葉，但內(nèi)外突幾乎等大，且鉤尖較短；本種僅有一聯(lián)結(jié)片，而重唇魚指環(huán)蟲和D.drjagini含有背、腹兩個(gè)聯(lián)結(jié)片；交接器的差異也尤為明顯。但本種與前蘇聯(lián)文獻(xiàn)記載的單式指環(huán)蟲[12]進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征比較后，發(fā)現(xiàn)兩者形態(tài)非常相似，僅交接管基部的形態(tài)以及聯(lián)結(jié)片中部有略微差別。兩者交接管基部的“漏斗狀”肌質(zhì)的包裹狀態(tài)不太一樣，該形態(tài)的差異可能是由于蟲體的觀察角度不同[20]。本種的聯(lián)結(jié)片中部略微“凸”出，而先前文獻(xiàn)中單式指環(huán)蟲的聯(lián)結(jié)片呈“一”字，該結(jié)構(gòu)的差異可能是因?yàn)榘l(fā)育和寄生蟲對(duì)宿主或局部環(huán)境的適應(yīng)而發(fā)生的變化[21]。此外，對(duì)特征形態(tài)的測(cè)量值對(duì)比發(fā)現(xiàn)(表1)，兩者的測(cè)量值差異不顯著(P>0.05)。因此，從斑重唇魚鰓部采集的指環(huán)蟲為單式指環(huán)蟲，該種在我國(guó)尚未報(bào)道，為我國(guó)一新紀(jì)錄種。

圖3 重唇魚指環(huán)蟲(A)、D.drjagini(B)、單式指環(huán)蟲[前蘇聯(lián)(C)]、單式指環(huán)蟲[本研究(D)]幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.3 Comparison of the chitinous structure of Dactylogyrus diptychus (A),D.drjagini (B),D.simplex (C,former Soviet Union),D.simplex (D,the present study)a.中央大鉤，b.邊緣小鉤，c.背聯(lián)結(jié)片，d.腹聯(lián)結(jié)片，e.交接器A、B、C圖比例尺：20 μm；D圖比例尺：10 μm

表1 新紀(jì)錄種與斑重唇魚寄生指環(huán)蟲的形態(tài)特征比較Tab.1 Comparison of the morphological characteristics of the newly recorded species and the known Dactylogyrus of the D.maculates μm

傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)一直作為鑒定和研究指環(huán)蟲的主要方法，但隨著科技的發(fā)展，形態(tài)學(xué)的局限性逐漸被人們所意識(shí)到，因而有學(xué)者開(kāi)始探索研究指環(huán)蟲其它方法，以補(bǔ)充和完善傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的不足及其局限性[22]。Cunningham等[23]是將分子生物學(xué)方法應(yīng)用于單殖吸蟲研究的首位學(xué)者。本研究基于18S-ITS1-5.8S rDNA序列構(gòu)建的BI樹(shù)顯示，單式指環(huán)蟲與鯽屬魚類寄生的美麗指環(huán)蟲、錨鉤指環(huán)蟲及弧形指環(huán)蟲聚為一支，其親緣關(guān)系較近，而單式指環(huán)蟲與同種宿主上寄生的重唇魚指環(huán)蟲分別位于不同的兩支。該結(jié)果可能與地理隔離對(duì)宿主魚類的影響相關(guān)[24-25]。