于 峰，張曼紅，劉建洋

(山東紳聯(lián)藥業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250000)

鹽酸普拉克索(pramipexole hydrochloride)是一種非麥角類選擇性多巴胺(DA)受體激動劑，與多巴胺受體D2亞家族結(jié)合具有高度的選擇性和特異性，對其中的D3受體有優(yōu)先親和力，并具有完全的內(nèi)在活性，能有效改善早期及晚期帕金森病的運(yùn)動癥狀，延緩和減輕左旋多巴導(dǎo)致的相關(guān)運(yùn)動并發(fā)癥的發(fā)生，使用范圍廣，安全性好，目前已成為抗帕金森病治療的一線藥物[1-3]。本品的原研廠家為德國勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingellheim)，是2007年在我國批準(zhǔn)上市的新型抗帕金森病藥物。臨床上與左旋多巴聯(lián)合使用可有效改善中晚期帕金森病患者的運(yùn)動狀態(tài)，同時可緩解帕金森病患者伴發(fā)的抑郁癥狀，避免因長期使用左旋多巴造成的神經(jīng)損害[4]，延緩治療時間及降低使用劑量，可大大提高患者的生活質(zhì)量[5-6]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測定鹽酸普拉克索的有關(guān)物質(zhì)，此方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于鹽酸普拉克索的有關(guān)物質(zhì)檢查。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-15C高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測器(DAD檢測器))；QUINTIX125D-1CN電子天平(賽多利斯公司)；FE-28臺式酸度計(梅特勒-托利多)。

1.2 試藥

鹽酸普拉克索樣品(自制，批號：191201、191202、191203)；鹽酸普拉克索對照品(化 學(xué) 名：(S)-2-氨基-6-丙氨基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑二鹽酸鹽一水合物，來源：U.S.Pharmacopeia，批號：G0L469，含量：每1mg含C10H17N3S·2HCl·H2O0.998 mg)；雜質(zhì)A對照品(化學(xué)名：(6S)-4,5,6,7-四氫-1,3-苯并噻唑-2,6-二胺，來源：Toronto Research Chemical Inc.，批號：21-XJZ-69-1，含量：98 %)；雜質(zhì)B對照品(化 學(xué) 名：6S-N,N-二異丙基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2,6-二胺二鹽酸鹽，來源：TLC PharmaChem,Inc.，批 號：1392-083A8，含量：98.5 %)；鄰硝基苯基硫乙酸對照品(化 學(xué) 名：(2-硝基苯基)硫代乙酸，來 源：Cato Research Chemicals Inc.，批 號：C3D-1077-1401，含量：98.7 %)；雜質(zhì)Ⅰ對照品(化學(xué)名：鄰硝基苯磺酸，自制，批號：Y191001，含量：88.9 %(滴定))；雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌?化學(xué)名：(S)-N,N-(4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2,6-二基)雙(2-硝基苯磺酰胺)，自制，批號：Y181201，含量：94.0 %)；雜質(zhì)Ⅲ對照品(化學(xué)名：(S)-N,N-二丙基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2,6-二胺，自制，批號：Y191203,含量：98.6 %)；雜質(zhì)Ⅳ對照品(化學(xué)名：(S)-2-硝基-N-正丙基-N-(2-(丙氨基)-4,5,6,7-四氫苯并噻唑)苯磺酰胺，自制，批號：191205，含量：98.9 %)；雜質(zhì)Ⅴ對照品(化學(xué)名：(S)-N-(2-(二丙氨基)-4,5,6,7-四氫苯并噻唑)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺，自制，批號：191102，含量：96.8 %)；雜質(zhì)Ⅵ對照品(化學(xué)名：(S)-2-硝基-N-(6-(丙氨基)-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2-基)苯磺酰胺，自制，批號：191104，含量：99.6 %)；乙腈(色譜純，ASTOON，4L/瓶)；水(市售純凈水，杭州哇哈哈哈集團(tuán))，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

取鹽酸普拉克索約15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸普拉克索溶液。

取中間體1((S)-N-(2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-6-基)-2-硝基苯磺酰胺)約15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為中間體1溶液。

取中間體2((S)-N-(2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-6-基)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺)約15mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加乙腈適量溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為中間體2溶液。取雜質(zhì)Ⅰ約5 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅰ溶液。

取雜質(zhì)Ⅱ約10 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅱ溶液。

取雜質(zhì)Ⅲ約5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅲ溶液。

取雜質(zhì)Ⅳ約5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅳ溶液。

取雜質(zhì)Ⅴ約10 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅴ溶液。

取雜質(zhì)Ⅵ約5 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)Ⅵ溶液。

取雜質(zhì)A約10 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)A溶液。

取雜質(zhì)B約5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)B溶液。

取鄰硝基苯硫乙酸約5 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鄰硝基苯硫乙酸溶液。

取上述溶液各1 mL，混勻，作為混合溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，以pH值 3.0緩沖液(取辛烷磺酸鈉5.0 g與磷酸二氫鉀9.1 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)為流動相A，以pH值 3.0緩沖液-乙腈(30∶70)為流動相B，梯度洗脫(0 min～40 min，70 % A；40 min～45 min，0 % A；45.1 min～55 min，70 % A)流速1.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長264 nm，進(jìn)樣量5 μL，稀釋劑為pH值 3.0緩沖液-乙腈(80:20)。試驗(yàn)結(jié)果見表1，色譜圖見圖1。在選定試驗(yàn)條件下各雜質(zhì)均能實(shí)現(xiàn)基線分離。

表1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.3 專屬性試驗(yàn)

取本品約15 mg，精密稱定，按表2的破壞方法進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)。破壞后放冷，加稀釋劑稀釋至10 mL，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取各供試品溶液5 μL，分別注入液相色譜儀，試驗(yàn)結(jié)果見表3。由試驗(yàn)結(jié)果可知，本品在高溫、酸、堿、光照降解條件下未見明顯雜質(zhì)產(chǎn)生，較為穩(wěn)定；氧化降解條件下，主要降解產(chǎn)物為氧化降解產(chǎn)物1和氧化降解產(chǎn)物2，分別占1.519 %和0.478 %。主峰與雜質(zhì)之間均能實(shí)現(xiàn)基線分離，表明改方法專屬性良好。并根據(jù)降解前后峰面積計算物料平衡，結(jié)果見表3。

表2 鹽酸普拉克索強(qiáng)制降解試驗(yàn)破壞條件

表3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果(面積歸一化法)

2.4 線性試驗(yàn)

按線性試驗(yàn)要求，配制系列濃度的的線性溶液，按“2.2”項下的色譜條件進(jìn)樣，以溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，同時計算各雜質(zhì)的定量限(LOQ)和檢測限(LOD)，結(jié)果見表4。

表4 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用2名實(shí)驗(yàn)人員在不同時間、不同設(shè)備上，分別平行測定6份供試品溶液，其中雜質(zhì)A和雜質(zhì)B均未檢出，計算鄰硝基苯硫乙酸、其他最大單雜和總雜質(zhì)含量的RSD(n=12)分別為4.6 %，2.0 %和2.3 %。

取新配制的對照品溶液和供試品溶液，室溫放置12小時，并于0，2，4，8，12 h時，精密量取各溶液5 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。對照品溶液主峰面積各時間點(diǎn)RSD為0.48 %，與0 h相比，無顯著性差異。供試品溶液中各時間點(diǎn)最大單個雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均小于0.1 %，RSD均為1.0 %，其他雜質(zhì)均未檢出。結(jié)果表明，室溫條件下，對照品溶液和供試品溶液均在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn)

取鹽酸普拉克索適量，精密稱定，加稀釋劑制成每1mL含1.5μg的溶液，分別加入0.2%、1.0%、1.5%的雜質(zhì)對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計算，鄰硝基苯硫乙酸、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的平均回收率(n=9)分別為99.1%，101.5%，98.2%，RSD分別為1.5 %，2.1 %，1.2 %。

2.7 樣品測定

取三批自研產(chǎn)品(批號：191201、191202、190203)，按“2.2”項下的色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，鄰硝基苯硫乙酸按外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計算，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和其它雜質(zhì)按主成分自身對照法計算。結(jié)果見表5。

表5 樣品測定結(jié)果 %

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

根據(jù)合成工藝，鹽酸普拉克索在264 nm處有最大吸收，中間體1、中間體2、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、鄰硝基苯硫乙酸、雜質(zhì)Ⅲ、雜質(zhì)Ⅳ、雜質(zhì)Ⅴ、雜質(zhì)Ⅵ各工藝雜質(zhì)均在264 nm波長附近有最大吸收，雜質(zhì)Ⅱ在290 nm處有最大吸收。根據(jù)降解試驗(yàn)結(jié)果，主要降解雜質(zhì)氧化產(chǎn)物1和氧化產(chǎn)物2的特征吸收，二者在264 nm處均有較強(qiáng)吸收。因此，選擇264 nm作為本試驗(yàn)有關(guān)物質(zhì)檢測用波長，可將各雜質(zhì)有效成分檢出，且分離度符合要求。

3.2 色譜條件

本試驗(yàn)對流動相B中pH值 3.0緩沖液和乙腈的不同比例進(jìn)行了篩選，并對梯度洗脫程序進(jìn)行了考察，最終確定了流動相比例和梯度洗脫程序。在選定色譜條件下，各色譜峰之間均能達(dá)到有效分離，且各色譜峰純度均達(dá)100 %。

3.3 雜質(zhì)含量計算方法

雜質(zhì)A、雜質(zhì)B的校正因子分別為0.6、1.0，雜質(zhì)B校正因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，為嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，將雜質(zhì)A、雜質(zhì)B和其他未知單雜均采用不加校正因子的主成分自身對照法進(jìn)行計算。鄰硝基苯硫乙酸校正因子為1.0，鄰硝基苯硫乙酸為遺傳毒性雜質(zhì)，為嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，其含量采用外標(biāo)法以峰面積進(jìn)行計算。