吳 平,任 紅,韓丹丹,高文秀,蘆 菲
(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)
銅廣泛存在于生物體內(nèi),是很多蛋白質(zhì)和酶的組成部分,對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的吸收,血紅蛋白的合成以及形成皮膚,頭發(fā)和眼睛的色素都起到重要的作用,在人體中的微量金屬元素含量?jī)H次于鋅和鐵,在各種生物過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用?;罴?xì)胞必須維持一定濃度的銅離子,以保持酶的正常功能和細(xì)胞內(nèi)代謝平衡[1-2]。另一方面,工業(yè)污染引起的水體銅污染會(huì)在一定程度上對(duì)人們的身體健康造成嚴(yán)重影響。進(jìn)入21世紀(jì),由于汽車產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展相應(yīng)帶動(dòng)冶金、電鍍等行業(yè),也為工業(yè)污水檢測(cè)和治理帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。為監(jiān)測(cè)生物、環(huán)境內(nèi)銅或其他生物活性物質(zhì)的變化,運(yùn)用有機(jī)小分子熒光探針進(jìn)行細(xì)胞成像等技術(shù)開(kāi)始涌現(xiàn),并誕生了很多優(yōu)異的銅離子探針[3-6]。
從反應(yīng)機(jī)理來(lái)看,銅離子探針一般分為兩類:“開(kāi)-關(guān)”、“關(guān)-開(kāi)”。由于Cu2+本身順磁特性,“開(kāi)-關(guān)”熒光探針比“關(guān)-開(kāi)”探針更常見(jiàn);但“開(kāi)-關(guān)”分子探針與Cu2-離子作用時(shí)表現(xiàn)出明顯熒光強(qiáng)度增強(qiáng),避免在某些特定環(huán)境下出現(xiàn)熒光猝滅的假陽(yáng)性結(jié)果,因而“關(guān)-開(kāi)”型探針比“開(kāi)-關(guān)”型更具吸引力[7]。目前報(bào)道的“關(guān)-開(kāi)”型銅離子熒光探針在礦泉水水質(zhì)監(jiān)測(cè)[8-9]和游泳館的水樣[10]分析等環(huán)境和食品藥品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域已發(fā)揮作用;成功地用于Vero[11]、人張氏肝細(xì)胞[12]、Hela[13]、MCF-7[14-16]和HepG2[9]等細(xì)胞的熒光成像,在生物檢測(cè)以及疾病的診斷方面有機(jī)小分子探針同樣具有傳統(tǒng)儀器分析方法不可替代的優(yōu)勢(shì)。本文重點(diǎn)對(duì)近五年來(lái)基于小分子的“關(guān)-開(kāi)”型銅(II)離子熒光探針的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行歸納。
生活中有很多應(yīng)用銅的例子,比如游泳池由于使用銅離子來(lái)進(jìn)行消毒而往往顯藍(lán)色。為監(jiān)測(cè)泳池水的含銅量,Xie等成功將對(duì)稱席夫堿型探針PMBB分子(10 μM)應(yīng)用于山西大學(xué)不同地點(diǎn)和時(shí)段游泳池水樣中Cu2+離子檢測(cè),熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了明顯增強(qiáng)[10];Patra 等將席夫堿類配體L應(yīng)用于蒸餾水和市售膳食補(bǔ)充劑葡萄糖酸銅中微量Cu2+離子檢測(cè),均取得了良好的效果。具體如下:蒸餾水樣品中,Cu2+離子濃度范圍為8~11 μM,回收率達(dá)到98 %以上,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%~1.5 %;測(cè)得葡萄糖酸銅中Cu2+離子含量為5.23 μM,添加3 μM的Cu2+離子,回收率為97.8 %,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.3 %[14]。
由于剛果紅探針(BDA)水溶性較差,故Tang等將其溶解于DMSO/H2O(v∶v=1∶9)溶劑。在康師傅飲用礦化水樣中添加0.1~1.2 μM的Cu2+離子并進(jìn)行檢測(cè),回收率97.5%~102%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.4%~3.0 %之間[8]。
除了直接將探針?lè)肿佑糜趯?shí)際樣品的檢測(cè),有研究者通過(guò)制備濾紙條的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)金屬離子的直觀識(shí)別。通過(guò)濾紙條顏色的變化,可以快速識(shí)別出微量Cu2+離子的存在[17]。我們研究團(tuán)隊(duì)將尺寸為1.0 cm × 4.0 cm濾紙條浸泡在化合物2'-羥基-間二氨基偶氮苯(L1-OH)的乙醇溶液,快速?gòu)娜芤褐心贸霾⒏稍?0 min,得黃色濾紙條備用。然后,將處理過(guò)的濾紙條浸在不同金屬離子(Cu2+,Na+,K+,Ca2+,Ag+,Pb2+,Zn2+,Mn2+,Mg2+,Al3+和Ni2+)的水溶液中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只有在含Cu2+的水溶液中濾紙條瞬間變成了淺粉色。通過(guò)這種具有視覺(jué)特性的濾紙條,使人們能直觀地觀察到變色現(xiàn)象。且Cu2+離子與L1-OH存在可逆的配合作用,在絡(luò)合Cu2+之后,試紙?jiān)俳腧蟿〦DTA溶液,可以將Cu2+萃取出,試紙由粉變黃,成功實(shí)現(xiàn)再生。檢測(cè)試紙對(duì)市售“泉陽(yáng)泉”牌礦泉水中的銅離子進(jìn)行檢測(cè)(水中偏硅酸含量25.0~35.0 mg/L,另有Ca2+、Na+、K+和Mg2+離子),當(dāng)?shù)V泉水樣品中未添加金屬銅離子時(shí),分析試紙為黃色;當(dāng)?shù)V泉水樣品中添加金屬銅離子(濃度為10,20,30,100 μM),分析試紙呈現(xiàn)粉色,并隨著銅離子濃度增大,試紙顏色不斷加深,說(shuō)明該分析試紙可實(shí)現(xiàn)礦泉水樣品中銅離子的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),也可用于長(zhǎng)白山水源地水質(zhì)監(jiān)測(cè)(圖1)[9]。
圖1 經(jīng)L1-OH處理的試紙?jiān)诘渭覥u2+離子后顏色發(fā)生變化(黃→粉)[9]
Cu2+離子普遍存在于活細(xì)胞,起到調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要作用,快速、準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Cu2+離子的濃度及分布,具有重要的分析價(jià)值。與“開(kāi)-關(guān)”型銅熒光探針相比,“關(guān)-開(kāi)”型在降低背底方面優(yōu)勢(shì)明顯。為檢驗(yàn)“關(guān)-開(kāi)”型銅熒光探針在生物體系里的適用性,目前有很多用于生物熒光成像的細(xì)胞,比如人乳腺癌MCF-7、Vero細(xì)胞、人張氏肝細(xì)胞和Hela細(xì)胞等。
Patra等將喹啉取代的席夫堿類配體L應(yīng)用在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞成像中[14],當(dāng)單獨(dú)用Cu2+和探針L處理時(shí),在37 ℃下孵育40 h后,細(xì)胞保持非熒光狀態(tài);但MCF-7細(xì)胞用20 μM L處理,再加入30 μM Cu2+后,發(fā)出亮綠色熒光。Liu等合成的TPI-AD也體現(xiàn)了良好的生物樣品實(shí)用性,研究者將MCF-7細(xì)胞在37℃下用20 μM的TPI-AD處理30 min,接下來(lái)將處理過(guò)的MCF-7細(xì)胞與Cu2+(80 μM)在37℃下再培養(yǎng)30min,CLSM圖像顯示明顯熒光,表明TPI-AD探針具有良好的細(xì)胞通透性和針對(duì)Cu2+離子的熒光增強(qiáng)行為,在生物系統(tǒng)內(nèi)具有潛在的應(yīng)用前景[15]。
此外,張長(zhǎng)麗合成香豆素探針Cou-P,用MTT法檢測(cè)探針相對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性,探針濃度為2~50 μM。結(jié)果表明,Cou-P對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性較低,用于Cu2+的生物顯像是安全的。MCF-7細(xì)胞在37℃單獨(dú)與Cou-P(10 μM)孵育30 min,未見(jiàn)明顯熒光。然而,當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步與Cu2+(200 μM)孵育300min時(shí),可以觀察到熒光顯著增強(qiáng)[16]。
Singh等成功地將芘聯(lián)吡啶腙為母體的HL探針應(yīng)用于Vero細(xì)胞成像,在25 μM HL濃度下經(jīng)同濃度Cu2+處理后的Vero細(xì)胞可顯示綠色熒光成像。在10 μM HL濃度的溶液中,Vero細(xì)胞在24 h后活體存活率仍高達(dá)95%以上,在25 μM HL濃度下Vero細(xì)胞24 h后活體存活率達(dá)60%,低毒性、高靈敏度使得HL在生物細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[11]。
Kongsaeree等以人張氏肝細(xì)胞為研究對(duì)象來(lái)證明以羅丹明為母體的熒光探針RHT的生物成像性,首先用RHT(5 μM)孵育肝細(xì)胞,分別在PBS緩沖液和Cu(OAc)2(1mM)溶液中各放置1h,細(xì)胞再用DAPI(4?,6-二氨基-2-苯基吲哚)核染色劑復(fù)染,在515 nm激發(fā)下觀察熒光成像。亮場(chǎng)圖像顯示細(xì)胞形態(tài)在熒光響應(yīng)過(guò)程中無(wú)損,表明RHT對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。RHT和Cu2+共同孵育的肝細(xì)胞顯示出熒光發(fā)射,而僅用RHT處理的細(xì)胞無(wú)熒光發(fā)射(圖2)[12]。
圖2 (a)顯微鏡下的人張氏肝細(xì)胞;(b)在RHT探針作用下,人張氏肝細(xì)胞熒光成像[12]
Majumdar等使用苯并咪唑取代的羅丹明探針1在活Hela細(xì)胞中檢測(cè)Cu2+,研究者用濃度3 μM的探針1處理細(xì)胞?;铙w細(xì)胞成像溫度為37 °C,濕度90%,二氧化碳濃度為5%,共焦顯微鏡下1標(biāo)記的HeLa細(xì)胞圖像顯示出微弱的熒光,這說(shuō)明活Hela細(xì)胞本身存在低含量的Cu2+離子;細(xì)胞經(jīng)過(guò)Cu2+(200 μM)的預(yù)處理,熒光強(qiáng)度顯著增加。此外,特定區(qū)域內(nèi)探針1標(biāo)記過(guò)的HeLa細(xì)胞在525 nm條件下激發(fā),細(xì)胞可在1h內(nèi)保持高度光穩(wěn)定性[13]。
為了開(kāi)發(fā)探針?lè)肿拥纳飸?yīng)用前景,我們研究團(tuán)隊(duì)將2□-羥基-間二氨基偶氮苯(L1-OH)對(duì)活體HepG2細(xì)胞進(jìn)行熒光成像,采用cck8法測(cè)試了細(xì)胞活性,結(jié)果表明在20~80 μM L1-OH的水溶液中,活體細(xì)胞在24 h后仍可保持90%以上的高OD百分值[9]。在PBS緩沖體系中,HepG2細(xì)胞用L1-OH(40 μM)培養(yǎng)30 min,后用PBS反復(fù)清洗細(xì)胞三次,然后用CuSO4(0.5 mM)持續(xù)處理1h,經(jīng)L1-OH預(yù)處理后HepG2細(xì)胞可觀察到明顯的綠色熒光發(fā)射。目前,Cu2+的熒光檢測(cè)方法日益豐富,如量子點(diǎn)[18]、貴金屬納米簇[19]、納米氧化鋁[20]和MOFs[21]等方法在Cu2+檢測(cè)中也取得了實(shí)效,將這些新興技術(shù)與有機(jī)小分子探針結(jié)合將大大地拓展銅離子熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)域。
本文對(duì)近五年來(lái)“關(guān)-開(kāi)”型Cu2+熒光探針的應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行了歸納。理想的Cu2+離子熒光探針應(yīng)具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好和不破壞等優(yōu)點(diǎn)。目前有機(jī)小分子熒光感應(yīng)檢測(cè)銅離子取得了階段性成果,但探針?lè)肿铀苄暂^差,溶劑的選擇多為甲醇、乙醇和乙腈等有機(jī)溶劑,水溶劑的應(yīng)用較少,成為在環(huán)境和生物樣品中的展開(kāi)實(shí)際應(yīng)用的障礙;此外,應(yīng)用于生物體系,有機(jī)小分子的毒性亦是一個(gè)必須解決的重要問(wèn)題,因此構(gòu)造高效環(huán)保的新型銅離子熒光探針在環(huán)境、生物方面具有可觀的應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)還可促進(jìn)化學(xué)、材料、環(huán)境和生物的學(xué)科的綜合交叉和有機(jī)融合,具有重要的學(xué)術(shù)意義。