吳 平，任 紅，韓丹丹，高文秀，蘆 菲

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

銅廣泛存在于生物體內(nèi)，是很多蛋白質(zhì)和酶的組成部分，對(duì)調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的吸收，血紅蛋白的合成以及形成皮膚，頭發(fā)和眼睛的色素都起到重要的作用，在人體中的微量金屬元素含量僅次于鋅和鐵，在各種生物過程中起著至關(guān)重要的作用。活細(xì)胞必須維持一定濃度的銅離子，以保持酶的正常功能和細(xì)胞內(nèi)代謝平衡[1-2]。另一方面，工業(yè)污染引起的水體銅污染會(huì)在一定程度上對(duì)人們的身體健康造成嚴(yán)重影響。進(jìn)入21世紀(jì)，由于汽車產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展相應(yīng)帶動(dòng)冶金、電鍍等行業(yè)，也為工業(yè)污水檢測(cè)和治理帶來新的挑戰(zhàn)。為監(jiān)測(cè)生物、環(huán)境內(nèi)銅或其他生物活性物質(zhì)的變化，運(yùn)用有機(jī)小分子熒光探針進(jìn)行細(xì)胞成像等技術(shù)開始涌現(xiàn)，并誕生了很多優(yōu)異的銅離子探針[3-6]。

從反應(yīng)機(jī)理來看，銅離子探針一般分為兩類：“開-關(guān)”、“關(guān)-開”。由于Cu2+本身順磁特性，“開-關(guān)”熒光探針比“關(guān)-開”探針更常見；但“開-關(guān)”分子探針與Cu2-離子作用時(shí)表現(xiàn)出明顯熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，避免在某些特定環(huán)境下出現(xiàn)熒光猝滅的假陽性結(jié)果，因而“關(guān)-開”型探針比“開-關(guān)”型更具吸引力[7]。目前報(bào)道的“關(guān)-開”型銅離子熒光探針在礦泉水水質(zhì)監(jiān)測(cè)[8-9]和游泳館的水樣[10]分析等環(huán)境和食品藥品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域已發(fā)揮作用；成功地用于Vero[11]、人張氏肝細(xì)胞[12]、Hela[13]、MCF-7[14-16]和HepG2[9]等細(xì)胞的熒光成像，在生物檢測(cè)以及疾病的診斷方面有機(jī)小分子探針同樣具有傳統(tǒng)儀器分析方法不可替代的優(yōu)勢(shì)。本文重點(diǎn)對(duì)近五年來基于小分子的“關(guān)-開”型銅(II)離子熒光探針的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行歸納。

1 銅離子探針在環(huán)境和食品藥品分析中的應(yīng)用

生活中有很多應(yīng)用銅的例子，比如游泳池由于使用銅離子來進(jìn)行消毒而往往顯藍(lán)色。為監(jiān)測(cè)泳池水的含銅量，Xie等成功將對(duì)稱席夫堿型探針PMBB分子(10 μM)應(yīng)用于山西大學(xué)不同地點(diǎn)和時(shí)段游泳池水樣中Cu2+離子檢測(cè)，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了明顯增強(qiáng)[10]；Patra 等將席夫堿類配體L應(yīng)用于蒸餾水和市售膳食補(bǔ)充劑葡萄糖酸銅中微量Cu2+離子檢測(cè)，均取得了良好的效果。具體如下：蒸餾水樣品中，Cu2+離子濃度范圍為8～11 μM，回收率達(dá)到98 %以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～1.5 %；測(cè)得葡萄糖酸銅中Cu2+離子含量為5.23 μM，添加3 μM的Cu2+離子，回收率為97.8 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.3 %[14]。

由于剛果紅探針(BDA)水溶性較差，故Tang等將其溶解于DMSO/H2O(v∶v=1∶9)溶劑。在康師傅飲用礦化水樣中添加0.1～1.2 μM的Cu2+離子并進(jìn)行檢測(cè)，回收率97.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.4%～3.0 %之間[8]。

除了直接將探針分子用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，有研究者通過制備濾紙條的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)金屬離子的直觀識(shí)別。通過濾紙條顏色的變化，可以快速識(shí)別出微量Cu2+離子的存在[17]。我們研究團(tuán)隊(duì)將尺寸為1.0 cm × 4.0 cm濾紙條浸泡在化合物2'-羥基-間二氨基偶氮苯(L1-OH)的乙醇溶液，快速從溶液中拿出并干燥20 min，得黃色濾紙條備用。然后，將處理過的濾紙條浸在不同金屬離子(Cu2+，Na+,K+,Ca2+,Ag+,Pb2+,Zn2+,Mn2+,Mg2+,Al3+和Ni2+)的水溶液中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明只有在含Cu2+的水溶液中濾紙條瞬間變成了淺粉色。通過這種具有視覺特性的濾紙條，使人們能直觀地觀察到變色現(xiàn)象。且Cu2+離子與L1-OH存在可逆的配合作用，在絡(luò)合Cu2+之后，試紙?jiān)俳腧蟿〦DTA溶液，可以將Cu2+萃取出，試紙由粉變黃，成功實(shí)現(xiàn)再生。檢測(cè)試紙對(duì)市售“泉陽泉”牌礦泉水中的銅離子進(jìn)行檢測(cè)(水中偏硅酸含量25.0～35.0 mg/L，另有Ca2+、Na+、K+和Mg2+離子)，當(dāng)?shù)V泉水樣品中未添加金屬銅離子時(shí)，分析試紙為黃色；當(dāng)?shù)V泉水樣品中添加金屬銅離子(濃度為10，20，30，100 μM)，分析試紙呈現(xiàn)粉色，并隨著銅離子濃度增大，試紙顏色不斷加深，說明該分析試紙可實(shí)現(xiàn)礦泉水樣品中銅離子的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，也可用于長白山水源地水質(zhì)監(jiān)測(cè)(圖1)[9]。

圖1 經(jīng)L1-OH處理的試紙?jiān)诘渭覥u2+離子后顏色發(fā)生變化(黃→粉)[9]

2 探針在生物分子中的熒光成像

Cu2+離子普遍存在于活細(xì)胞，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要作用，快速、準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Cu2+離子的濃度及分布，具有重要的分析價(jià)值。與“開-關(guān)”型銅熒光探針相比，“關(guān)-開”型在降低背底方面優(yōu)勢(shì)明顯。為檢驗(yàn)“關(guān)-開”型銅熒光探針在生物體系里的適用性，目前有很多用于生物熒光成像的細(xì)胞，比如人乳腺癌MCF-7、Vero細(xì)胞、人張氏肝細(xì)胞和Hela細(xì)胞等。

Patra等將喹啉取代的席夫堿類配體L應(yīng)用在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞成像中[14]，當(dāng)單獨(dú)用Cu2+和探針L處理時(shí)，在37 ℃下孵育40 h后，細(xì)胞保持非熒光狀態(tài)；但MCF-7細(xì)胞用20 μM L處理，再加入30 μM Cu2+后，發(fā)出亮綠色熒光。Liu等合成的TPI-AD也體現(xiàn)了良好的生物樣品實(shí)用性，研究者將MCF-7細(xì)胞在37℃下用20 μM的TPI-AD處理30 min，接下來將處理過的MCF-7細(xì)胞與Cu2+(80 μM)在37℃下再培養(yǎng)30min，CLSM圖像顯示明顯熒光，表明TPI-AD探針具有良好的細(xì)胞通透性和針對(duì)Cu2+離子的熒光增強(qiáng)行為，在生物系統(tǒng)內(nèi)具有潛在的應(yīng)用前景[15]。

此外，張長麗合成香豆素探針Cou-P，用MTT法檢測(cè)探針相對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性，探針濃度為2～50 μM。結(jié)果表明，Cou-P對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的毒性較低，用于Cu2+的生物顯像是安全的。MCF-7細(xì)胞在37℃單獨(dú)與Cou-P(10 μM)孵育30 min，未見明顯熒光。然而，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)一步與Cu2+(200 μM)孵育300min時(shí)，可以觀察到熒光顯著增強(qiáng)[16]。

Singh等成功地將芘聯(lián)吡啶腙為母體的HL探針應(yīng)用于Vero細(xì)胞成像，在25 μM HL濃度下經(jīng)同濃度Cu2+處理后的Vero細(xì)胞可顯示綠色熒光成像。在10 μM HL濃度的溶液中，Vero細(xì)胞在24 h后活體存活率仍高達(dá)95%以上，在25 μM HL濃度下Vero細(xì)胞24 h后活體存活率達(dá)60%，低毒性、高靈敏度使得HL在生物細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景[11]。

Kongsaeree等以人張氏肝細(xì)胞為研究對(duì)象來證明以羅丹明為母體的熒光探針RHT的生物成像性，首先用RHT(5 μM)孵育肝細(xì)胞，分別在PBS緩沖液和Cu(OAc)2(1mM)溶液中各放置1h，細(xì)胞再用DAPI(4?,6-二氨基-2-苯基吲哚)核染色劑復(fù)染，在515 nm激發(fā)下觀察熒光成像。亮場(chǎng)圖像顯示細(xì)胞形態(tài)在熒光響應(yīng)過程中無損，表明RHT對(duì)細(xì)胞無毒。RHT和Cu2+共同孵育的肝細(xì)胞顯示出熒光發(fā)射，而僅用RHT處理的細(xì)胞無熒光發(fā)射(圖2)[12]。

圖2 (a)顯微鏡下的人張氏肝細(xì)胞；(b)在RHT探針作用下，人張氏肝細(xì)胞熒光成像[12]

Majumdar等使用苯并咪唑取代的羅丹明探針1在活Hela細(xì)胞中檢測(cè)Cu2+，研究者用濃度3 μM的探針1處理細(xì)胞?；铙w細(xì)胞成像溫度為37 °C，濕度90%，二氧化碳濃度為5%，共焦顯微鏡下1標(biāo)記的HeLa細(xì)胞圖像顯示出微弱的熒光，這說明活Hela細(xì)胞本身存在低含量的Cu2+離子；細(xì)胞經(jīng)過Cu2+(200 μM)的預(yù)處理，熒光強(qiáng)度顯著增加。此外，特定區(qū)域內(nèi)探針1標(biāo)記過的HeLa細(xì)胞在525 nm條件下激發(fā)，細(xì)胞可在1h內(nèi)保持高度光穩(wěn)定性[13]。

為了開發(fā)探針分子的生物應(yīng)用前景，我們研究團(tuán)隊(duì)將2□-羥基-間二氨基偶氮苯(L1-OH)對(duì)活體HepG2細(xì)胞進(jìn)行熒光成像，采用cck8法測(cè)試了細(xì)胞活性，結(jié)果表明在20～80 μM L1-OH的水溶液中，活體細(xì)胞在24 h后仍可保持90%以上的高OD百分值[9]。在PBS緩沖體系中，HepG2細(xì)胞用L1-OH(40 μM)培養(yǎng)30 min，后用PBS反復(fù)清洗細(xì)胞三次，然后用CuSO4(0.5 mM)持續(xù)處理1h，經(jīng)L1-OH預(yù)處理后HepG2細(xì)胞可觀察到明顯的綠色熒光發(fā)射。目前，Cu2+的熒光檢測(cè)方法日益豐富，如量子點(diǎn)[18]、貴金屬納米簇[19]、納米氧化鋁[20]和MOFs[21]等方法在Cu2+檢測(cè)中也取得了實(shí)效，將這些新興技術(shù)與有機(jī)小分子探針結(jié)合將大大地拓展銅離子熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)域。

3 結(jié)語

本文對(duì)近五年來“關(guān)-開”型Cu2+熒光探針的應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行了歸納。理想的Cu2+離子熒光探針應(yīng)具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡單、重現(xiàn)性好和不破壞等優(yōu)點(diǎn)。目前有機(jī)小分子熒光感應(yīng)檢測(cè)銅離子取得了階段性成果，但探針分子水溶性較差，溶劑的選擇多為甲醇、乙醇和乙腈等有機(jī)溶劑，水溶劑的應(yīng)用較少，成為在環(huán)境和生物樣品中的展開實(shí)際應(yīng)用的障礙；此外，應(yīng)用于生物體系，有機(jī)小分子的毒性亦是一個(gè)必須解決的重要問題，因此構(gòu)造高效環(huán)保的新型銅離子熒光探針在環(huán)境、生物方面具有可觀的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)還可促進(jìn)化學(xué)、材料、環(huán)境和生物的學(xué)科的綜合交叉和有機(jī)融合，具有重要的學(xué)術(shù)意義。