趙甜甜，楊寧寧，宋新強(qiáng)

(信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

鉤藤，為茜草科植物鉤藤(Uncariarhynchophylla)及其同屬植物華鉤藤(U.sinensis)、毛鉤藤(U.hirsute)等的干燥帶鉤莖枝[1]。性涼，味甘，具有息風(fēng)定驚、清熱平肝的功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明其具有降壓[3]、鎮(zhèn)靜[4]、鎮(zhèn)痛[5]、和抗氧化[6]等藥理作用，用于治療高血壓、頭痛眩暈、阿爾茨海默等疾病[7]。鉤藤中的化學(xué)成分主要包括生物堿、萜類、和黃酮等。鉤藤堿和異鉤藤堿是其最具代表性的藥理活性成分[8]。有研究發(fā)現(xiàn)從鉤藤中分離出的兒茶素具有對抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)[9]。但是，目前關(guān)于鉤藤總黃酮的研究甚少，本實驗以鉤藤總黃酮含量為評價指標(biāo)，采用單因素篩選、正交試驗法優(yōu)化乙醇加熱回流法提取鉤藤總黃酮的工藝條件,為充分開發(fā)鉤藤藥用價值提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

鉤藤購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均購自成都市科龍化工試劑廠；蘆丁對照品(成都曼思特有限公司，批號：MUST-16111111)。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器

紫外分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品5 mg，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度線，即得0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取蘆丁對照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分別置于10mL容量瓶中，加純水2mL，加入5%的NaNO2溶液0.3mL，混勻，靜置6min，然后加入10%的AL(NO3)3試劑0.3mL,混勻，靜置6min，再加入4%的NaOH試劑4mL，加入純水定容至刻度線后搖勻，靜置15min。于波長510nm處測定吸光度。以溶液溶度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=11.24C-0.0214(R2=0.9961)，在0.0207～0.0611mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 總黃酮含量的測定

取鉤藤提取液適量，并稀釋至10mL，精密吸取2 mL，按“2.2”項下方法進(jìn)行顯色，于510nm波長處測定供試品溶液的吸光度，據(jù)回歸方程計算黃酮得率。

3 鉤藤總黃酮提取工藝的優(yōu)化

3.1 提取方法的比較

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，結(jié)合生產(chǎn)常用提取方法,分別考察水煎煮、乙醇超聲提取、乙醇加熱回流提取3種提取方法。①水煎煮提?。喝°^藤粗粉1g，加入30倍水，80℃提取30min，提取1次，過濾，于100mL容量瓶中定容。②乙醇超聲提?。喝°^藤粗粉1g，加30倍60%乙醇，溫度30℃，350W超聲提取30min，提取1次，過濾，于100mL容量瓶中定容。③乙醇加熱回流提?。喝°^藤粗粉1g，用30倍60%乙醇，80℃加熱回流提取30min，提取1次，過濾，于100mL容量瓶中定容。

按“2.3”項下方法進(jìn)行總黃酮含量測定，計算黃酮得率。結(jié)果見表1。結(jié)果表明乙醇加熱回流提取效果最好，明顯優(yōu)于水煎煮提取和乙醇超聲提取法，所以選擇乙醇加熱回流提取。

表1 不同提取方法的比較

3.2 單因素考察

3.2.1 溶劑用量對總黃酮提取效率的影響

取鉤藤藥材1g，設(shè)置提取時間為30min，提取溫度為50 ℃，以60%的乙醇溶液作為提取溶劑，考察溶劑用量分別為20,30,40,50,60倍時對鉤藤總黃酮提取率的影響。如下圖1所示。

圖1 溶劑用量對總黃酮提取效率的影響

3.2.2 乙醇濃度對總黃酮提取效率的影響

取鉤藤藥材1g，設(shè)置提取時間為30min，提取溫度為50 ℃，溶劑用量為50倍，考察乙醇濃度分別為40%,50%,60%,70%,80%時對鉤藤總黃酮提取率的影響。如下圖2所示。

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取效率的影響

3.2.3 提取時間對總黃酮提取效率的影響

取鉤藤藥材1g，設(shè)置提取溫度為50 ℃，溶劑用量為50倍，以50%的乙醇溶液作為提取溶劑，考察提取時間30,40,50,60,70min對鉤藤總黃酮提取率的影響。如下圖3所示。

圖3 提取時間對總黃酮提取效率的影響

3.2.4 提取溫度對總黃酮提取效率的影響

取鉤藤藥材1g，設(shè)置提取時間為60min，溶劑用量為50倍，以50%的乙醇溶液作為提取溶劑，考察提取溫度為50,60,70,80,90℃時對鉤藤總黃酮提取率的影響。如下圖4所示。

圖4 提取溫度對總黃酮提取效率的影響

由圖1可知，隨著溶劑用量的不斷增加，鉤藤總黃酮的提取率先增加后減少。當(dāng)溶劑用量達(dá)到50倍時，提取率最高；當(dāng)溶劑用量高于50倍時，總黃酮提取率迅速下降，因此，選擇50倍乙醇作為提取溶劑量最為合適。

由圖2可知，隨著乙醇濃度的不斷增加，鉤藤總黃酮的提取率先增加后減少。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時，提取率最高；當(dāng)乙醇濃度高于50%時，總黃酮提取率反而下降，可能是因為高濃度的乙醇溶液會抑制黃酮的溶出。因此，選擇50%乙醇作為提取溶劑最為合適。

由圖3可知，隨著提取時間的不斷增加，鉤藤總黃酮的提取率先增加后減少。當(dāng)提取時間達(dá)到60 min時，提取率最高；當(dāng)提取時間高于60 min時，總黃酮提取率反而下降，可能是因為隨著提取時間的延長，部分總黃酮會受到破壞而分解。因此，選擇60 min作為提取溶劑最為合適。

由圖4可知，隨著提取溫度的不斷增加，鉤藤總黃酮的提取率先增加后減少。當(dāng)提取溫度達(dá)到80℃時，提取率最高；當(dāng)提取溫度高于80℃時，總黃酮提取率反而下降?？赡苁且驗殡S著溫度的升高，分子的熱運(yùn)動加快，隨之提取率增加，溫度升高至80℃時，過多的雜質(zhì)會溶解出來，影響提取效果。因此，選擇80℃作為提取溶劑最為合適。

3.3 正交設(shè)計

在前期單因素試驗基礎(chǔ)上,以乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)為影響因素,以總黃酮提取率為評價指標(biāo)，采用四因素三水平L9(34)進(jìn)行正交試驗設(shè)計。因素與水平見表2,試驗安排與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析結(jié)果

由表3正交試驗結(jié)果分析可知，影響鉤藤總黃酮提取效率因素的強(qiáng)弱順序為：D>B>C>A，即提取溫度>溶劑用量>提取時間>乙醇濃度。說明提取溫度對鉤藤總黃酮的提取率的影響最大，乙醇濃度對鉤藤總黃酮提取率的影響最小。

根據(jù)表4方差分析結(jié)果可知，D(提取溫度)對總黃酮得提取率影響顯著(p<0.05)，溶劑用量、提取時間和乙醇濃度影響均不顯著。所以最佳提取工藝條件為A1B3C3D3，即乙醇濃度40%，溶劑用量50倍，提取時間70min，提取溫度90℃。

3.4 驗證試驗

按照上述試驗得到的最佳提取工藝條件,平行進(jìn)行3次提取試驗,測得鉤藤總黃酮的提取率分別為9.156%，9.244%，9.482%，3次測定的平均值為9.294%。表明該工藝穩(wěn)定可行。

4 討論

本文篩選出鉤藤的最佳提取工藝為乙醇加熱回流提取法。通過乙醇加熱回流提取法的工藝優(yōu)化，優(yōu)選出鉤藤總黃酮的最佳提取工藝，即在溫度為90 ℃時加入50倍乙醇，提取70min可使鉤藤總黃酮的提取率達(dá)到9.294%。

乙醇回流提取法相對于水煎煮和超聲提取來說，操作簡單，設(shè)備要求低、成本低廉，且提取效率最高。同時溶劑能循環(huán)使用,整個提取過程中沒有任何污染。