馮麗娜， 王莉麗， 周燁民， 王秀峰， 劉鑫鑫， 侯旭日

(陜西科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 陜西省無機材料綠色制備與功能化重點實驗室, 陜西 西安 710021)

0 引言

近年來，骨科類疾病及相關(guān)損害的發(fā)生率迅速增加，成為對健康的重大威脅.雖然目前的給藥方式能有效地預(yù)防和緩解骨病癥狀，但大多存在有效性低、副作用大等問題[1,2].羥基磷灰石(HA)是人體硬組織的主要成分，由于其良好的生物相容性、生物活性、骨傳導(dǎo)性和對藥物、蛋白質(zhì)及DNA的高親和力，被廣泛用作藥物傳遞、非病毒基因、抗原、酶和蛋白質(zhì)的載體[3-5].

研究表明，骨中大多數(shù)天然磷灰石是非化學(xué)計量學(xué)(缺鈣磷灰石晶體)，由許多取代元素組成，如陽離子(Mg2+、Mn2+、Zn2+、Na+)或陰離子(HPO42-或CO32-)[6-8].在所有這些離子中，Zn2+和Mg2+是骨和結(jié)締組織所需的微量元素，在體外和體內(nèi)，通過刺激成骨細胞的增殖和膠原合成，對成骨細胞骨形成有特異性的成骨作用，對成骨細胞骨吸收有選擇性的抑制作用[9].

此外，Zn2+和Mg2+可以通過改變樣品性質(zhì)直接或間接影響磷酸鈣的生物活性，對骨骼組織的生理過程產(chǎn)生直接影響[10-12].考慮到Zn2+、Mg2+的重要作用，將其摻入HA可以有效地影響HA的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)[13].因此，與純HA相比，摻雜的HA在生物材料中具有更大的應(yīng)用潛力[14].

目前，許多學(xué)者對于鋅和鎂分別摻雜的HA在生物醫(yī)用材料方面進行了大量的研究.Hyehyun Kim等[15]采用共沉淀技術(shù)合成了純相及摻鋅納米HA作為抗癌藥物阿霉素的載體并進行對比分析.結(jié)果表明，相比于純相HA，摻鋅納米HA明顯改善了對藥物的負載量，提升了樣品的負載能力.Dasgupta等[16]通過對純相、摻鋅及摻鎂納米HA作為蛋白質(zhì)藥物載體的制備并進行了體外藥物緩釋實驗，結(jié)果表明，鋅鎂摻雜HA的藥物釋放速率均高于純相HA，并證明鋅鎂的摻雜提高了HA的生物降解能力.

雖然已有大量對摻鋅摻鎂HA作為藥物載體的研究報道，但大多都專注于單一摻雜，針對的是納米HA的摻雜研究.本文提出將反蛋白石結(jié)構(gòu)用于藥物緩釋來控制藥物的釋放速率，通過膠晶模板法制備不同摻雜量的鋅鎂共摻反蛋白石HA藥物載體，分析了不同鋅鎂摻雜量對HA的形貌、物相、官能團的影響規(guī)律，進行以阿莫西林為藥物模型的藥物緩釋性能實驗，探究鋅鎂摻雜量對其藥物緩釋性能的影響規(guī)律及內(nèi)在機理并將其與純相反蛋白石HA進行了對比分析.

1 實驗部分

1.1 原料

硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O，純度≥99.0%，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)、氯化鎂(MgCl2·6H2O，純度≥98.0%，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)氯化鋅(ZnCl2，純度≥98.0%，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)無水乙醇(C2H5OH，純度≥99.7%，天津市富宇精細化工有限公司).

1.2 鋅鎂共摻前后反蛋白石羥基磷灰石的制備

以苯乙烯單體為原料，采用無皂乳液聚合法制備了聚苯乙烯(PS)微球，通過蒸發(fā)自組裝制備了PS膠晶模板.以硝酸鈣和磷酸氫二銨為鈣源和磷源，保持鈣與磷摩爾比為1.67.將鈣源溶于乙醇溶液，磷源溶于水溶液，待完全溶解且混合后，調(diào)節(jié)溶液pH約為10，于40 ℃下恒溫攪拌48 h，制備了混合分散劑體系HA前驅(qū)體.取1 g制備好的PS膠晶模板均勻平鋪在外徑為80 mm的布氏漏斗中.稱取15 g的HA前驅(qū)體，用膠頭滴管均勻地滴在PS膠晶模板上，浸漬5 min后抽濾5 min.抽濾后的樣品盛放于瓷舟中，在室溫下放置24 h待晾干后放入電阻爐中去除樣品中的有機物微球，得到反蛋白石HA.按照氯化鋅與氯化鎂摩爾比1∶1取代鈣，且鋅鎂加入量分別為1 mol%、2 mol%、3 mol%、4 mol%和5 mol%，保持鈣鋅鎂與磷源的摩爾比為約為1.67.在其它工藝不變的情況下制備了不同摻雜量的鋅鎂共摻反蛋白石HA.

1.3 鋅鎂摻雜前后反蛋白石羥基磷灰石藥物緩釋性能實驗

配制濃度為10 mg/mL的阿莫西林/PBS緩沖液.將上述制備的樣品各取10 g浸泡在200 mL的混合液中，在室溫下靜置24 h后，將溶液過濾，取出固體于60 ℃烘干，烘干后的質(zhì)量變化即為載藥量.將載藥完成的樣品置于200 mL的PBS緩沖液中，保持溫度為37 ℃靜置，起初10 h內(nèi)，在2 h、3 h、6 h和10 h分別取2 mL的上清液放入離心管內(nèi)待測，同時補充相同濃度的新鮮PBS緩沖液.之后每隔5 h取一次樣并加入相同濃度的PBS緩沖液直到40 h后.

1.4 樣品表征

PS膠晶模板、純相HA及鋅鎂共摻反蛋白石HA的微觀形貌由場發(fā)射電子顯微鏡(S-4800，日立公司)表征.鋅鎂共摻前后反蛋白石HA的物相由X射線衍射儀(D/max2200PC，理學(xué)公司，日本)分析.采用Renishaw-invia型顯微共焦激光拉曼光譜儀對鋅鎂共摻前后反蛋白石HA的官能團進行測定；不同鋅鎂共摻雜量及摻雜前后反蛋白石HA的載藥量由分析天平測定.采用紫外分光光度計測定純相HA及鋅鎂共摻反蛋白石HA的釋藥性能.

2 結(jié)果與討論

2.1 鋅鎂共摻反蛋白石羥基磷灰石微觀形貌分析

圖1為單分散的PS微球和PS膠體晶體模板的SEM圖.由圖1(a)可知，制備的PS微球表面清潔、形貌規(guī)則、單分散性良好、平均粒徑為380±10 nm.由圖1(b)可知，PS膠體晶體模板排列良好，基本按照密排六方排列，此工藝下制備出了形貌完整，質(zhì)量優(yōu)良的PS膠晶模板.

(a)PS微球 (b)膠晶模板圖1 PS微球及膠晶體模板的SEM圖

圖2為不同鋅鎂共摻雜量的反蛋白石HA的SEM圖.由圖2可知，不同鋅鎂共摻雜量下樣品的微觀形貌都呈現(xiàn)出反蛋白石結(jié)構(gòu)，但是隨著鋅鎂摻雜量的增多，樣品的微觀形貌中缺陷增多，結(jié)構(gòu)松散并殘留些許前驅(qū)體雜質(zhì).

如圖2(a)所示，當(dāng)鋅鎂共摻量均為1 mol%時，制得的樣品基本呈現(xiàn)出良好的反蛋白石結(jié)構(gòu)，少部分區(qū)域出現(xiàn)了未完全浸漬的前驅(qū)體雜質(zhì)粘連覆蓋在孔結(jié)構(gòu)上.隨著鋅鎂共摻雜量的增加，如圖2(b)～(d)所示，樣品中的反蛋白石結(jié)構(gòu)缺陷增加，孔壁發(fā)生坍塌、變形、缺失，孔結(jié)構(gòu)被堵塞且顆粒細化，未浸入模板空隙中的前驅(qū)體增多并覆蓋在PS微球上，導(dǎo)致煅燒后團聚形成塊狀殘留物覆蓋在反蛋白石結(jié)構(gòu)表面.由于鋅源鎂源的引入，在制備前驅(qū)體溶液時隨著摻雜量增多會改變前驅(qū)體的成分，煅燒時產(chǎn)生其他不同相.在煅燒過程中，不同相的橫向或縱向生長速度不同，導(dǎo)致反蛋白石結(jié)構(gòu)的孔壁厚薄不同，孔壁間的結(jié)合力不同使孔壁變形、缺失.因此，當(dāng)鋅鎂共摻雜量均為1 mol%時，得到了缺陷較少，形貌基本良好的反蛋白石HA.

(a)1 mol% (b)2 mol%

(c)3 mol% (d)4mol%

(e)5mol%圖2 不同鋅鎂摻雜量的反蛋白石羥基磷灰石的SEM圖

2.2 鋅鎂共摻雜前后反蛋白石羥基磷灰石微觀形貌分析

圖3為鋅鎂共摻雜前后反蛋白石HA的形貌及拉曼分析.由圖3可知，鋅鎂共摻雜前后樣品的微觀形貌中都呈現(xiàn)出反蛋白石結(jié)構(gòu).在摻雜1 mol%鋅和1 mol%鎂后，樣品表面有塊狀、棒狀前驅(qū)體殘留，且有較為明顯的孔壁坍塌及殘留物覆蓋孔道的缺陷存在，如圖3(a)所示.相比之下，未摻雜的反蛋白石HA顯示出孔壁完整、殘留物較少的良好的微觀形貌，如圖3(b)所示.在毛細管力和抽力作用下，前驅(qū)體溶液基本完全填充至PS模板的空隙中，因此能夠?qū)⒌鞍资Y(jié)構(gòu)完整的拓印，在煅燒后獲得了孔壁厚薄均勻，孔徑大小均一，結(jié)構(gòu)較為完整反蛋白石HA[17].圖3(c)為鋅鎂共摻前后樣品的拉曼圖.鋅鎂摻雜后(PO4)3-位于431 cm-1處的拉曼峰幾乎消失，處于631 cm-1、1 062 cm-1處的拉曼峰發(fā)生位移且峰變得低且寬.這與Yuan等[18]的研究結(jié)果一致.

(c)拉曼圖3 鋅鎂共摻雜前后反蛋白石羥基磷灰石的SEM及拉曼圖

2.3 鋅鎂共摻雜前后對反蛋白石羥基磷灰石的物相分析

圖4為鋅鎂共摻雜前后反蛋白石HA的XRD圖譜.由圖4(a)可知，不同鋅鎂摻雜量下的樣品的衍射峰均與HA標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS卡號09-0432)的特征峰相對應(yīng).當(dāng)鋅鎂摻雜量為1 mol%時，樣品為較為純凈的HA.當(dāng)摻雜量為2 mol%時，樣品的物相發(fā)生改變，主晶相衍射峰降低且變寬，同時開始出現(xiàn)β-TCP相(JCPDS卡號09-0169).隨著摻雜量從3 mol%增加至5 mol%，主晶相衍射峰向β-TCP相偏移量明顯，次級峰降低并消失，同時出現(xiàn)了第三相(Ca2.589Mg0.411)(PO4)2(JCPDS卡號87-1582).當(dāng)Zn、Mg摻雜入HA后，取代鈣形成新的配位多面體，Zn2+、Mg2+與Ca2+之間半徑差異導(dǎo)致晶格參數(shù)略有收縮.因此，當(dāng)摻雜量較小時，煅燒后獲得物相單一，但隨著鋅鎂摻雜量的增加，結(jié)晶度明顯降低.

圖4(b)為鋅鎂共摻前后對比圖，如圖所示，未摻雜的反蛋白石HA衍射峰尖銳，峰值較高，結(jié)晶度較好.鋅鎂摻雜量為1% mol的樣品中，(211)晶面的主晶相衍射峰下降，且摻雜后(511)晶面的特征峰近乎消失，摻雜后樣品的結(jié)晶度降低.另一方面，Suchanek等[19]通過對鋅鎂摻雜量低于1% mol的HA結(jié)構(gòu)研究可知，低于1% mol的摻雜對晶格及物相的影響程度較低，進而對HA理化性質(zhì)的改善能力較微弱.綜上，鋅鎂共摻雜量為1% mol時得到的樣品較符合實驗要求.

(a)不同鋅鎂共摻量

(b)摻前雜后對比圖圖4 鋅鎂共摻雜前后反蛋白石HA的XRD圖

2.4 不同鋅鎂摻雜量的反蛋白石羥基磷灰石藥物緩釋性能的分析

圖5為不同鋅鎂共摻量下的反蛋白石HA的藥物緩釋性能圖.由圖5(a)可知，不同鋅鎂共摻雜量的樣品對阿莫西林藥物負載量分別為92.144、76.236、62.809、46.921和39.556 mg/g，載藥量隨著共摻雜量的增加而減少.當(dāng)鋅鎂共摻雜量為1 mol%時，樣品對阿莫西林負載能力較大.由吸附質(zhì)和吸附劑分子間作用力所引起的吸附稱為物理吸附[20].在本實驗中，藥物載體羥基磷灰石與阿莫西林分子之間存在著普遍的弱吸附力，即物理吸附.一方面，由于鋅鎂摻雜量的增加使樣品的反蛋白石結(jié)構(gòu)缺陷增多，比表面積減小，物理吸附能力下降；另一方面，本實驗中，阿莫西林藥物分子在溶液中由于脫質(zhì)子化苯酚的存在帶負電荷[21]，對于HA，由于氫氧根離子在材料表面的吸附，樣品表面帶負電，但隨著鋅鎂摻雜量的增加樣品表面的負電荷逐漸減少，這使得摻雜后的樣品的與阿莫西林顆粒之間的靜電力增強.兩者共同作用下導(dǎo)致隨著共摻雜的增加，載藥能力下降.綜上，鋅鎂共摻雜量為1 mol%的反蛋白石HA顯示出對阿莫西林較高的負載能力.

由圖5(b)可知，不同摻雜量下的樣品均展示出對阿莫西林良好的緩釋能力.在前5 h內(nèi)，均能將藥物累積釋放率控制在50%內(nèi)，最終累積釋放率除摻雜量為1 mol%的樣品外均超過90%.由于釋藥初期溶液中濃度差較大.因此，對阿莫西林藥物的釋放速率較快，之后逐漸降低.隨著摻雜量的增加，藥物載體與阿莫西林藥物顆粒之間的靜電力隨著摻雜量增加而增強，導(dǎo)致吸附的藥物顆粒難以釋放.因此，鋅鎂共摻量為1 mol%的反蛋白石HA具有較好的藥物緩釋性能.

(a)載藥

(b)釋藥圖5 不同鋅鎂共摻雜量的反蛋白石HA的藥物緩釋性能圖

2.5 鋅鎂共摻雜前后反蛋白石羥基磷灰石藥物緩釋性能分析

圖6為鋅鎂共摻雜前后反蛋白石HA藥物緩釋性能分析.由圖6(a)可知，鋅鎂共摻雜為1 mol%的HA載藥量為92.144 mg/g，與未摻雜樣品的載藥量相比得到了極大的改善.由于藥物分子吸附過程中主要依靠物理吸附和靜電力相互作用，摻雜1 mol%后的反蛋白石HA，微觀形貌中缺陷產(chǎn)生的較少，比表面積變化不大，故而產(chǎn)生的物理吸附能力的差異變化不大，吸附能力的差異主要產(chǎn)生于摻雜后樣品與藥物分子間的靜電力相互作用和晶格變形而暴露的更多的活性吸附位點，鋅鎂粒子的摻雜均會使HA晶格畸變而產(chǎn)生活性吸附位點，但由于Mg2+(0.65 ?)半徑小于Zn2+(0.74 ?)，與Ca2+(0.99 ?)之間的畸變程度更加顯著[22]，因此，共摻雜中Mg2+對樣品的負載能力起著主導(dǎo)作用.綜上，鋅鎂共摻雜量為1 mol%的反蛋白石HA具有更好的藥物負載能力.

由圖6(b)可知，鋅鎂共摻雜前后的反蛋白石HA的藥物累積釋放率曲線相似，均在前5 h內(nèi)將藥物累積釋放率控制50%，都緩解了藥物的釋放速率.由于鋅鎂的摻雜，Zn2+和Mg2+替代缺失的Ca2+后靜電力相互作用增強以及微觀形貌的缺陷增加使物理吸附能力降低，共同影響下使得摻雜前后藥物的釋放能力差異較小.因此，鋅鎂共摻雜前后的反蛋白石HA的藥物釋放能力無明顯差異.

(a)載藥

(b)釋藥圖6 鋅鎂共摻雜前后的反蛋白石HA的藥物緩釋性能圖

3 結(jié)論

(1)通過調(diào)節(jié)前驅(qū)體溶液中Zn2+、Mg2+的含量，采用膠晶模板法成功制備了不同鋅鎂摻雜量(1%～5% mol)的反蛋白石HA.

(2)隨著鋅鎂共摻雜量的增加，樣品微觀形貌中缺陷增加，結(jié)晶度下降并出現(xiàn)雜相.鋅鎂共摻雜量為1mol%時的反蛋白石HA有較好的微觀形貌及結(jié)晶度，顯示出對阿莫西林良好的載藥性能.

(3)與未摻雜相比，當(dāng)鋅鎂共摻雜量為1 mol%時，由于摻雜后的晶格變形和缺陷增加，樣品暴露了更多活性吸附位點，摻雜后的有序多孔HA對阿莫西林的載藥能力得到明顯改善，對于該藥物的釋放能力，摻雜前后未發(fā)現(xiàn)有明顯改善.