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        高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定鮮活小龍蝦中孔雀石綠不確定度評定

        2020-11-24 04:12:50涂凡李佳文阮勝軍
        化學分析計量 2020年6期
        關(guān)鍵詞:標準

        涂凡,李佳文,阮勝軍

        (潛江市公共檢驗檢測中心,湖北潛江 433100)

        孔雀石綠是一種人工合成的三苯甲烷類有機化學物,既可以用作絲綢、皮革和紙張的染色劑,也可以作為殺菌劑,廣泛用于預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動物的鰓霉病、水霉病以及小瓜蟲病等[1]。國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn),孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠的三苯甲烷官能團具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用,且在生物體內(nèi)有明顯的蓄積現(xiàn)象[2–3]。隨著人們認識的加深和環(huán)保意識的提高,我國于2002 年將孔雀石綠列為禁用藥物[4]。

        近年來,小龍蝦產(chǎn)業(yè)迅速增長,消費市場異常火爆,已成為人們餐桌上的常備菜。小龍蝦產(chǎn)業(yè)逐步形成了集苗種繁育、健康養(yǎng)殖、加工流通、餐飲和節(jié)慶于一體的完整產(chǎn)業(yè)鏈[5]。2019 年全國有8 個省份檢出不合格水產(chǎn)品,檢出的禁用藥物主要是孔雀石綠和硝基呋喃代謝物等[6]。因此測定鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量具有重要意義。

        目前測定孔雀石綠的方法主要有高效液相色譜法[7–9]和液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法[10–13]。筆者依據(jù)GB/T 19857–2005 《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》[14]、JJF 1059.1–2012 《測量不確定度評定與表示》[15]及CNAS–GL006:2019 《化學分析中不確定度的評估指南》[16],對高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量的不確定度進行分析和評定,旨在找出檢測方法中不確定度的主要來源,確定測定結(jié)果的主要影響因素及可信程度,為正確評價檢測結(jié)果提供科學依據(jù)。

        1 實驗部分

        1.1 主要儀器與試劑

        高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀:xevo TQD 型,美國沃特世公司;

        電子天平:YP1002N 型,感量為0.01 g,上海精密科學儀器有限公司;

        離心機:5804R 型,德國艾本德公司;

        旋渦混勻器:XW–80A 型,上海馳唐電子有限公司;

        超聲波清洗器:DTC–15 型,湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司;

        氮吹儀:HN200 型,濟南海能儀器股份有限 公司;

        孔雀石綠溶液標準物質(zhì):100 μg/mL,擴展不確定度為0.12 μg/mL(k=2),編號為SB05–285–2012,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所;

        氘代孔雀石綠溶液標準物質(zhì):50 μg/mL,擴展不確定度為2 μg/mL(k=2),編號為NY1701028a,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心;

        冰乙酸:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

        乙酸銨:色譜純,美國賽默飛世爾科技有限 公司;

        乙腈:色譜純,美國天地有限公司;

        中性氧化鋁柱:1 g/3 mL,美國艾杰爾公司;

        鮮活小龍蝦:湖北潛江小龍蝦交易中心采集。

        1.2 儀器工作條件

        1.2.1 色譜條件

        色譜柱:C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國沃特世公司);柱溫:40℃;流量:0.3 mL/min;進樣體積:10 μL;流動相:乙腈–5 mmol/L 乙酸銨緩沖溶液(體積比為75∶25)。

        1.2.2 質(zhì)譜條件

        離子源:電噴霧離子源,正離子模式(ESI);噴霧電壓:3.00 kV;去溶劑氣溫度:450℃;霧化氣流量:900 L/h;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;特征離子:孔雀石綠m/z 329/313(定量離子),329/208;氘代孔雀石綠m/z 334/318(定量離子)。

        1.3 溶液配制

        乙酸銨緩沖溶液:5 mmol/L,稱取0.385 g 乙酸銨溶解于1 000 mL 水中,加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至4.5。

        孔雀石綠標準儲備溶液:100 ng/mL,吸取1 mL 孔雀石綠溶液標準物質(zhì),置于100 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋并定容至標線,搖勻,配制成孔雀石綠的質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的標準中間溶液;吸取10 mL 上述標準中間溶液至100 mL 容量瓶中,用乙腈定容至標線,搖勻。

        系列孔雀石綠標準工作溶液:分別吸取0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mL 孔雀石綠標準儲備溶液,置于6只10 mL 容量瓶中,用乙腈定容至標線,搖勻,配制成孔雀石綠的質(zhì)量濃度分別為0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 ng/mL 的系列標準工作溶液。

        同位素內(nèi)標標準儲備溶液:1 μg/mL,吸取1 mL 氘代孔雀石綠溶液標準物質(zhì),置于50 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋并定容至標線,搖勻。

        同位素內(nèi)標標準溶液:100 ng/mL,吸取1 mL同位素內(nèi)標標準儲備溶液,置于10 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋并定容至標線,搖勻。

        1.4 標準工作曲線繪制

        在1.2 儀器工作條件下,分別對1.3 中的系列標準工作溶液進行測定,以孔雀石綠的質(zhì)量濃度為橫坐標,以色譜峰面積為縱坐標,繪制標準工作曲線。

        1.5 樣品前處理

        (1)提取。稱取5.00 g 已搗碎的鮮活小龍蝦樣品于50 mL 離心管中,加入200 μL 同位素內(nèi)標標準溶液,加入11 mL 乙腈,超聲波振蕩提取2 min,然后以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速勻漿提取30 s,再以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min,上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中;另取一只50 mL 離心管,加入11 mL 乙腈,洗滌勻漿刀頭10 s,洗滌液移入前一離心管中,用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀,于旋渦混勻器上振蕩30 s,超聲波震蕩5 min,然后以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min,上清液合并至25 mL 容量瓶中,用乙腈定容至標線,搖勻備用。

        (2)凈化。移取5 mL 樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱上,用10 mL 離心管接收流出液,以4 mL 乙腈洗滌中性氧化鋁柱,收集全部流出液,用氮吹儀吹至近干,殘液用乙腈定容至1.00 mL,超聲波震蕩5 min,加入5 mmol/L 乙酸銨緩沖溶液1 mL,超聲波震蕩1 min,樣品溶液經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾后待測。

        1.6 數(shù)學模型

        鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量按式(1)計算:

        式中:x——樣品中待測組分殘留量,μg/kg;

        c——待測組分的濃度,ng/mL ;

        V——樣品溶液最終定容體積,mL;

        m——樣品溶液試樣的質(zhì)量,g。

        1.7 不確定度來源分析

        根據(jù)測定過程和數(shù)學模型,鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量測定結(jié)果的不確定度主要來源于樣品稱量、樣品溶液制備、標準溶液配制、標準工作曲線擬合、測量重復(fù)性、回收試驗6 個方面。

        2 不確定度評定

        2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度ur(m)

        樣品稱量質(zhì)量為5 g,所用天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.03 g,按均勻分布(k= 3 ),樣品稱量引入的不確定度u(m)=0.03/ 3 =0.017 3 g,ur(m)=u(m)/5=0.003 5。

        2.2 樣品溶液制備引入的相對標準不確定度ur(V)

        (3)移液管引入的相對標準不確定度ur(V2)。移取5.00 mL 樣品 溶 液,按照JJG 196–2006 《常

        2.3 標準溶液配制引入的的相對標準不確定度ur(C)

        (1)標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度ur(p)。孔雀石綠溶液標準物質(zhì)證書給出的濃度值為100 μg/mL,擴展不確定度為0.12 μg/mL,擴展因子k=2,標準物質(zhì)引入的標準不確定度u(p)=0.12/2 =0.6 μg/mL,則標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度ur(p)=u(p)/100=0.006。由于ur(p)對內(nèi)標校準品和樣品的影響可相互抵消,所以內(nèi)標物質(zhì)純度引入的不確定度不予考慮。

        (2)移液器引入的相對標準不確定度ur(c1)。根據(jù)JJG 646–2006 《移液器檢定規(guī)程》,溶液定容過程中移液器引入的相對標準不確定度分量見表1。

        表1 移液器引入的相對標準不確定度分量

        (3)容量瓶引入的相對標準不確定度ur(c2)。根據(jù)JJG 196–2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》,溶液定容過程中容量瓶引入的相對標準不確定度分量見表2。

        溶液定容過程中容量瓶引入的相對標準不確定度:

        則溶液定容過程中移液器引入的相對標準不確定度:

        表2 容量瓶引入的相對標準不確定度分量

        2.4 標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度ur(Q)

        在1.2 儀器工作條件下,對1.3 中的系列標準工作溶液進行測定,結(jié)果見表3。以孔雀石綠的質(zhì)量濃度(c)為橫坐標、色譜峰面積(A)為縱坐標繪制標準工作曲線,計算得線性方程A=330.3c–7.791,相關(guān)系數(shù)為0.998。

        表3 孔雀石綠系列標準工作溶液色譜峰面積

        根據(jù)測定結(jié)果,鮮活小龍蝦樣品中均未檢出孔雀石綠,為更好地找出實驗方法中不確定度主要來源,假定鮮活小龍蝦中檢出孔雀石綠的質(zhì)量濃度c為4.0 μg/kg,則標準工作曲線擬合的標準偏差SR按式(2)計算:

        式中:A——標準工作曲線上每個測量點的計算值;

        Ai——每個測量點實際測量值;

        n——測量次數(shù)(n=5)。

        標準工作曲線擬合引入的標準不確定度按式(3)計算:

        將 表2 數(shù) 據(jù) 代 入 式(2) 和 式(3),計 算 得SR=52.240 3,則標準工作曲線擬合引入的標準不確定度u(Q)=0.102 7 ng/mL,相對標準不確定度ur(Q)=u(Q)/c=0.025 7

        2.5 測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度ur(rep)

        2.6 加標回收引入的相對標準不確定度ur(R)

        在1.2 儀器工作條件下,對小龍蝦樣品進行3 次加標回收實驗,回收率分別為90.2%,94.8%,93.0%,平均回收率為92.7%,用A 類評定方法中的極差法進行不確定度評定,加標回收引入的標準不確定度按式(4)計算:

        式中:R——極差,R=94.8%–90.2%;

        C——極差系數(shù),C=1.69;

        n——測量次數(shù),n=3。

        則加標回收引入的標準不確定度u(R)=1.509%,相對標準不確定度ur(R)=u(R)/92.7%=0.016 2。

        2.7 合成相對標準不確定度

        以上各不確定度分量相互獨立,互不相關(guān),則鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量合成相對標準不確定度:

        合成標準不確定度:

        2.8 擴展不確定度與測量結(jié)果表示

        按照95%的置信水品,取包含因子k=2,則擴展不確定度U=ku(x)=0.613 6 μg/kg ≈0.7 μg/kg。 鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量的測定結(jié)果為(4.0±0.7) μg/kg,k=2。

        3 結(jié)語

        依據(jù)GB/T 19857–2005 《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》,采用高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定了鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量,當鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量為4.0 μg/kg 時,擴展不確定度為0.7 μg/kg(k=2)。不確定度評定結(jié)果表明,樣品稱量、溫度變化、樣品溶液制備、標準溶液配制、標準曲線擬合、測量重復(fù)性、加標回收等過程均會引入不確定度,其中樣品溶液制備過程中引入的不確定度分量最大,主要原因在于離心管的精密度不高;其次是標準溶液配制過程,主要原因是標準溶液經(jīng)過多次稀釋定容。因此,在實際測定過程中,應(yīng)嚴格規(guī)范操作,提高熟練程度,使用更加精密的玻璃器皿,保證檢測結(jié)果準確可靠。

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