涂凡，李佳文，阮勝軍

(潛江市公共檢驗檢測中心，湖北潛江 433100)

孔雀石綠是一種人工合成的三苯甲烷類有機化學物，既可以用作絲綢、皮革和紙張的染色劑，也可以作為殺菌劑，廣泛用于預(yù)防和治療各類水產(chǎn)動物的鰓霉病、水霉病以及小瓜蟲病等［1］。國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠的三苯甲烷官能團具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用，且在生物體內(nèi)有明顯的蓄積現(xiàn)象［2–3］。隨著人們認識的加深和環(huán)保意識的提高，我國于2002 年將孔雀石綠列為禁用藥物［4］。

近年來，小龍蝦產(chǎn)業(yè)迅速增長，消費市場異常火爆，已成為人們餐桌上的常備菜。小龍蝦產(chǎn)業(yè)逐步形成了集苗種繁育、健康養(yǎng)殖、加工流通、餐飲和節(jié)慶于一體的完整產(chǎn)業(yè)鏈［5］。2019 年全國有8 個省份檢出不合格水產(chǎn)品，檢出的禁用藥物主要是孔雀石綠和硝基呋喃代謝物等［6］。因此測定鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量具有重要意義。

目前測定孔雀石綠的方法主要有高效液相色譜法［7–9］和液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［10–13］。筆者依據(jù)GB／T 19857–2005 《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》［14］、JJF 1059.1–2012 《測量不確定度評定與表示》［15］及CNAS–GL006：2019 《化學分析中不確定度的評估指南》［16］，對高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量的不確定度進行分析和評定，旨在找出檢測方法中不確定度的主要來源，確定測定結(jié)果的主要影響因素及可信程度，為正確評價檢測結(jié)果提供科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：xevo TQD 型，美國沃特世公司；

電子天平：YP1002N 型，感量為0.01 g，上海精密科學儀器有限公司；

離心機：5804R 型，德國艾本德公司；

旋渦混勻器：XW–80A 型，上海馳唐電子有限公司；

超聲波清洗器：DTC–15 型，湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司；

氮吹儀：HN200 型，濟南海能儀器股份有限 公司；

孔雀石綠溶液標準物質(zhì)：100 μg／mL，擴展不確定度為0.12 μg／mL(k=2)，編號為SB05–285–2012，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；

氘代孔雀石綠溶液標準物質(zhì)：50 μg／mL，擴展不確定度為2 μg／mL(k=2)，編號為NY1701028a，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心；

冰乙酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

乙酸銨：色譜純，美國賽默飛世爾科技有限 公司；

乙腈：色譜純，美國天地有限公司；

中性氧化鋁柱：1 g／3 mL，美國艾杰爾公司；

鮮活小龍蝦：湖北潛江小龍蝦交易中心采集。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；柱溫：40℃；流量：0.3 mL／min；進樣體積：10 μL；流動相：乙腈–5 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液(體積比為75∶25)。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子模式(ESI)；噴霧電壓：3.00 kV；去溶劑氣溫度：450℃；霧化氣流量：900 L／h；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；特征離子：孔雀石綠m／z 329／313(定量離子)，329／208；氘代孔雀石綠m／z 334／318(定量離子)。

1.3 溶液配制

乙酸銨緩沖溶液：5 mmol／L，稱取0.385 g 乙酸銨溶解于1 000 mL 水中，加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至4.5。

孔雀石綠標準儲備溶液：100 ng／mL，吸取1 mL 孔雀石綠溶液標準物質(zhì)，置于100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標線，搖勻，配制成孔雀石綠的質(zhì)量濃度為1 μg／mL 的標準中間溶液；吸取10 mL 上述標準中間溶液至100 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標線，搖勻。

系列孔雀石綠標準工作溶液：分別吸取0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 孔雀石綠標準儲備溶液，置于6只10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標線，搖勻，配制成孔雀石綠的質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 ng／mL 的系列標準工作溶液。

同位素內(nèi)標標準儲備溶液：1 μg／mL，吸取1 mL 氘代孔雀石綠溶液標準物質(zhì)，置于50 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標線，搖勻。

同位素內(nèi)標標準溶液：100 ng／mL，吸取1 mL同位素內(nèi)標標準儲備溶液，置于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標線，搖勻。

1.4 標準工作曲線繪制

在1.2 儀器工作條件下，分別對1.3 中的系列標準工作溶液進行測定，以孔雀石綠的質(zhì)量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.5 樣品前處理

（1）提取。稱取5.00 g 已搗碎的鮮活小龍蝦樣品于50 mL 離心管中，加入200 μL 同位素內(nèi)標標準溶液，加入11 mL 乙腈，超聲波振蕩提取2 min，然后以8 000 r／min 轉(zhuǎn)速勻漿提取30 s，再以4 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中；另取一只50 mL 離心管，加入11 mL 乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀，于旋渦混勻器上振蕩30 s，超聲波震蕩5 min，然后以4 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液合并至25 mL 容量瓶中，用乙腈定容至標線，搖勻備用。

（2）凈化。移取5 mL 樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱上，用10 mL 離心管接收流出液，以4 mL 乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，用氮吹儀吹至近干，殘液用乙腈定容至1.00 mL，超聲波震蕩5 min，加入5 mmol／L 乙酸銨緩沖溶液1 mL，超聲波震蕩1 min，樣品溶液經(jīng)0.2 μm 濾膜過濾后待測。

1.6 數(shù)學模型

鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量按式(1)計算：

式中：x——樣品中待測組分殘留量，μg／kg；

c——待測組分的濃度，ng／mL ；

V——樣品溶液最終定容體積，mL；

m——樣品溶液試樣的質(zhì)量，g。

1.7 不確定度來源分析

根據(jù)測定過程和數(shù)學模型，鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量測定結(jié)果的不確定度主要來源于樣品稱量、樣品溶液制備、標準溶液配制、標準工作曲線擬合、測量重復(fù)性、回收試驗6 個方面。

2 不確定度評定

2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度ur(m)

樣品稱量質(zhì)量為5 g，所用天平檢定證書給出的最大允許誤差為±0.03 g，按均勻分布(k= 3 )，樣品稱量引入的不確定度u(m)=0.03／ 3 =0.017 3 g，ur(m)=u(m)／5=0.003 5。

2.2 樣品溶液制備引入的相對標準不確定度ur(V)

（3）移液管引入的相對標準不確定度ur(V2)。移取5.00 mL 樣品 溶 液，按照JJG 196–2006 《常

2.3 標準溶液配制引入的的相對標準不確定度ur(C)

（1）標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度ur(p)。孔雀石綠溶液標準物質(zhì)證書給出的濃度值為100 μg／mL，擴展不確定度為0.12 μg／mL，擴展因子k=2，標準物質(zhì)引入的標準不確定度u(p)=0.12／2 =0.6 μg／mL，則標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度ur(p)=u(p)／100=0.006。由于ur(p)對內(nèi)標校準品和樣品的影響可相互抵消，所以內(nèi)標物質(zhì)純度引入的不確定度不予考慮。

（2）移液器引入的相對標準不確定度ur(c1)。根據(jù)JJG 646–2006 《移液器檢定規(guī)程》，溶液定容過程中移液器引入的相對標準不確定度分量見表1。

表1 移液器引入的相對標準不確定度分量

（3）容量瓶引入的相對標準不確定度ur(c2)。根據(jù)JJG 196–2006 《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，溶液定容過程中容量瓶引入的相對標準不確定度分量見表2。

溶液定容過程中容量瓶引入的相對標準不確定度：

則溶液定容過程中移液器引入的相對標準不確定度：

表2 容量瓶引入的相對標準不確定度分量

2.4 標準工作曲線擬合引入的相對標準不確定度ur(Q)

在1.2 儀器工作條件下，對1.3 中的系列標準工作溶液進行測定，結(jié)果見表3。以孔雀石綠的質(zhì)量濃度(c)為橫坐標、色譜峰面積(A)為縱坐標繪制標準工作曲線，計算得線性方程A=330.3c–7.791，相關(guān)系數(shù)為0.998。

表3 孔雀石綠系列標準工作溶液色譜峰面積

根據(jù)測定結(jié)果，鮮活小龍蝦樣品中均未檢出孔雀石綠，為更好地找出實驗方法中不確定度主要來源，假定鮮活小龍蝦中檢出孔雀石綠的質(zhì)量濃度c為4.0 μg／kg，則標準工作曲線擬合的標準偏差SR按式(2)計算：

式中：A——標準工作曲線上每個測量點的計算值；

Ai——每個測量點實際測量值；

n——測量次數(shù)(n=5)。

標準工作曲線擬合引入的標準不確定度按式(3)計算：

將 表2 數(shù) 據(jù) 代 入 式(2) 和 式(3)，計 算 得SR=52.240 3，則標準工作曲線擬合引入的標準不確定度u(Q)=0.102 7 ng／mL，相對標準不確定度ur(Q)=u(Q)／c=0.025 7

2.5 測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度ur(rep)

2.6 加標回收引入的相對標準不確定度ur(R)

在1.2 儀器工作條件下，對小龍蝦樣品進行3 次加標回收實驗，回收率分別為90.2%，94.8%，93.0%，平均回收率為92.7%，用A 類評定方法中的極差法進行不確定度評定，加標回收引入的標準不確定度按式(4)計算：

式中：R——極差，R=94.8%–90.2%；

C——極差系數(shù)，C=1.69；

n——測量次數(shù)，n=3。

則加標回收引入的標準不確定度u(R)=1.509%，相對標準不確定度ur(R)=u(R)／92.7%=0.016 2。

2.7 合成相對標準不確定度

以上各不確定度分量相互獨立，互不相關(guān)，則鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量合成相對標準不確定度：

合成標準不確定度：

2.8 擴展不確定度與測量結(jié)果表示

按照95%的置信水品，取包含因子k=2，則擴展不確定度U=ku(x)=0.613 6 μg／kg ≈0.7 μg／kg。 鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量的測定結(jié)果為(4.0±0.7) μg／kg，k=2。

3 結(jié)語

依據(jù)GB／T 19857–2005 《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》，采用高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定了鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量，當鮮活小龍蝦中孔雀石綠殘留量為4.0 μg／kg 時，擴展不確定度為0.7 μg／kg(k=2)。不確定度評定結(jié)果表明，樣品稱量、溫度變化、樣品溶液制備、標準溶液配制、標準曲線擬合、測量重復(fù)性、加標回收等過程均會引入不確定度，其中樣品溶液制備過程中引入的不確定度分量最大，主要原因在于離心管的精密度不高；其次是標準溶液配制過程，主要原因是標準溶液經(jīng)過多次稀釋定容。因此，在實際測定過程中，應(yīng)嚴格規(guī)范操作，提高熟練程度，使用更加精密的玻璃器皿，保證檢測結(jié)果準確可靠。