李麗蓓，王石，朱靖蓉，樊霞

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量與檢測(cè)技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091)

在20 世紀(jì)80 年代初，尿素作為反芻動(dòng)物蛋白質(zhì)代用料被我國廣泛使用。尿素可在反芻動(dòng)物消化道內(nèi)轉(zhuǎn)變成菌體蛋白，在消化酶作用下，被反芻家畜消化利用［1–3］。因尿素含氮量是粗蛋白質(zhì)的2倍多，反芻家畜利用尿素作為部分蛋白質(zhì)的來源，節(jié)約了蛋白飼料，降低了飼料成本。由于動(dòng)物飼養(yǎng)安全等原因，尿素只能供6 月齡以上反芻動(dòng)物使用。同時(shí)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在新修訂的《飼料添加劑安全使用規(guī)范》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2625 號(hào))中明確規(guī)定了尿素在配合飼料或全混合飼料中的最高限量為1.0%(以化合物計(jì))。其中用于肉牛、綿羊、山羊飼料的推薦添加量不大于1.0%；奶牛飼料的推薦添加量不大于0.6%［4］。

近年來，蛋白飼料價(jià)格不斷上漲，部分飼料生產(chǎn)企業(yè)為了追求更多利益，在飼料原料及反芻動(dòng)物飼料中超量添加尿素，牛、羊尿素中毒和死亡事件屢有發(fā)生，給牛、羊養(yǎng)殖企業(yè)或養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5］。為了監(jiān)測(cè)尿素在反芻動(dòng)物飼料中的添加量，防止超量、超范圍使用該類飼料添加劑，我國頒布了測(cè)定飼料中尿素含量的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB／T 36859–2018)［6］，然而對(duì)于飼料中尿素含量測(cè)定結(jié)果的不確定度等計(jì)量理論研究還沒有相關(guān)報(bào)道。

測(cè)量結(jié)果不確定度是評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果可信度和真實(shí)性的重要指標(biāo)，是判定測(cè)量結(jié)果可靠程度的依據(jù)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定是中國實(shí)驗(yàn)室國家認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)可準(zhǔn)則對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求［7］。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上［8–10］，采用對(duì)二甲氨基苯甲醛分光光度法測(cè)定飼料中尿素含量，分析測(cè)定過程中不確定度來源，對(duì)每個(gè)不確定度分量進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，明確測(cè)定過程中影響不確定度的主次因素，在提高檢測(cè)質(zhì)量的同時(shí)，為飼料中尿素檢測(cè)結(jié)果的科學(xué)評(píng)定提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外–可見分光光度計(jì)：Z–2300 型，配備30 mm 比色皿，日本日立公司；

電子天平：BP121S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司；

旋轉(zhuǎn)搖床：SK5200LHC 型，上?？茖?dǎo)超聲器有限公司；

超純水機(jī)：Million-Q 型，美國默克密理博公司；

比色管：25 mL，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；

比色皿：30 mm，北京欣維爾玻璃儀器有限 公司；

無水乙醇、乙酸、對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)、二水合乙酸鋅、三水合亞鐵氰化鉀、無水磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀：均為分析純，國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸：分析純，北京化工廠；

定性濾紙：中速，杭州特種紙業(yè)有限公司；

活性炭：南京先鋒納米科技有限公司；

尿素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：含量為99.8%±0.2%，編號(hào)為GBW 09201，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；

飼料樣品：由國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)提供；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Million-Q 型超純水機(jī)自制。

1.2 溶液配制

尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：10 mg／mL，稱取5 g 尿素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(精確至0.1 mg)于燒杯中，加入約50 mL 超純水溶解，完全轉(zhuǎn)移至500 mL 容量瓶中，用少量超純水沖洗燒杯壁兩次，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，搖勻，保存于4℃冰箱中備用。

尿素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：1.0 mg／mL，臨用前準(zhǔn)確吸取10.0 mL 尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL 容量瓶中，用超純水定容至標(biāo)線，搖勻。

磷酸鹽緩沖溶液：將3.403 g 無水磷酸二氫鉀和4.355 g 無水磷酸氫二鉀分別溶解于約100 mL超純水中，合并此溶液，用超純水稀釋至1 000 mL。

對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液：取1.6 g DMAB 溶于100 mL 的無水乙醇中，加入10 mL 鹽酸，混勻備用。

乙酸鋅溶液：稱取22.0 g 二水合乙酸鋅溶于超純水中，加入3 mL 乙酸，用超純水稀釋至100 mL。

亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6 g 三水合亞鐵氰化鉀，加入超純水溶解并稀釋至100 mL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

準(zhǔn)確吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，5.0 mL 尿素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別置于8 支25 mL 比色管中，各加入5.0 mL 磷酸鹽緩沖液和5.0 mL 對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液，然后加入超純水定容至標(biāo)線(此時(shí)溶液中尿素的質(zhì)量濃度分別為0，0.008，0.016，0.024，0.032，0.040，0.080，0.200 mg／mL)，搖勻，靜置20 min 進(jìn)行衍生。用30 mm 比色皿，以空白溶液為參比，于420 nm 波長處測(cè)定溶液吸光度。以尿素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4 樣品前處理與測(cè)定

1.4.1 樣品溶液制備

稱取約1.0 g(精確至0.1 mg)飼料樣品，置于100 mL 容量瓶中，加入1.0 g 活性炭，再加入約70 mL 超純水，搖勻，放置10 min，然后分別加入5 mL乙酸鋅溶液和5 mL 亞鐵氰化鉀溶液，振蕩提取30 min。用超純水定容至標(biāo)線，搖勻，靜置10 min。用中速濾紙過濾，收集濾液。如濾液呈現(xiàn)一定顏色，應(yīng)重新制備樣品溶液，并適當(dāng)增加活性炭用量，直至濾液呈現(xiàn)無色。平行制備兩份樣品溶液，同時(shí)做試劑空白。

1.4.2 樣品衍生與測(cè)定

準(zhǔn)確吸取上述樣品溶液5～10 mL 于25 mL 比色管中，加入5.0 mL 磷酸鹽緩沖液和5.0 mL 對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液，以超純水定容至標(biāo)線，混勻，衍生20 min。以試劑空白為參比，于420 nm 波長處測(cè)定溶液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上由吸光度查得尿素的質(zhì)量濃度，計(jì)算樣品中尿素含量。

1.5 數(shù)學(xué)模型

樣品中尿素含量X 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)計(jì)，按公式(1)計(jì)算：

式中：X——樣品中尿素含量，%；

c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的尿素的質(zhì)量濃度，mg／mL；

m——稱取的樣品質(zhì)量，g；

V——樣品提取液定容體積，mL；

V1——樣品測(cè)定時(shí)移取樣品提取液體積， mL；

V2——比色管體積，mL。

以兩次平行測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值作為測(cè)定結(jié)果，保留二位有效數(shù)字。

2 不確定度評(píng)定

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF 1059.1–2012)［11］，對(duì)飼料中尿素測(cè)定過程進(jìn)行數(shù)學(xué)模型分析，測(cè)量不確定度主要來源于5 個(gè)方面：(1)樣品前處理過程引入的不確定度；(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度；(3)樣品測(cè)定過程引入的不確定度；(4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度；(5)重復(fù)性測(cè)量引入的不確定度。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)，證書給出置信區(qū)間，而未說明置信水平的，被測(cè)量值落在該區(qū)間內(nèi)任意值處的可能性相同，如標(biāo)準(zhǔn)品純度、溫度對(duì)定容體積的影響、天平最大允許誤差的不確定度，按均勻分布(k=)計(jì)算；對(duì)于給出區(qū)間，未說明置信水平，若被測(cè)量值落在該區(qū)間中心的可能性最大，如容量瓶、吸量管等玻璃儀器的校準(zhǔn)不確定度，則按三角分布(k=)計(jì)算。對(duì)于測(cè)量過程中的各種隨機(jī)因素，包括環(huán)境條件、儀器狀態(tài)、人員操作、樣品自身特性以及前處理等因素導(dǎo)致的不確定度，綜合為整個(gè)測(cè)量過程的隨機(jī)效應(yīng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，采用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示［12–14］。

2.2 樣品處理過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(P)

按GB／T 36859–2018 方法制備樣品溶液，樣品處理過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要包括(1)樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel(P)；(2)樣品提取定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2，rel(P)；(3)樣品衍生引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3，rel(p)。

2.2.1 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel(P)

以上各不確定度分量相互獨(dú)立，則飼料樣品處理過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S)

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入不確定度主要包括(1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel(S)；(2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2，rel(S)；(3)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3，rel(S)；(4)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u4，rel(S)；(5)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定u5，rel(S)。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1，rel(S)

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 u3，rel(S)

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容用500 mL 容量瓶(B 級(jí))，定容溶劑為超純水。500 mL 容量瓶(B 級(jí))的容量允差為±0.50 mL，溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.000 364，對(duì)500 mL 容量瓶進(jìn)行10 次定容和稱量試驗(yàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.360 mL，同2.2.3(2)計(jì)算得500 mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.000 592，則標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u3，rel(S)=urel(500 mL)=0.000 592。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 u4，rel(S)

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制需使用10 mL 單標(biāo)線吸量管和100 mL 容量瓶。10 mL 單標(biāo)線吸量管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(10 mL)=0.001 152(見2.2.3)，100 mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(100 mL)=0.000 590(見2.2.2)。則標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.5 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確 定度u5，rel(S)

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中，以1 mL 分度吸量管(A 級(jí))、2 mL 和5 mL 單標(biāo)線吸量管(A 級(jí))分別吸取尿素標(biāo)準(zhǔn)工作液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，5.0 mL，置于8 只25 mL 容量瓶(A 級(jí))中，加入衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)，然后加入水定容至標(biāo)線，得到不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在此過程中需要使用1 mL 分度吸量管5 次，2 mL 單標(biāo)線吸量管1 次，5 mL 單標(biāo)線吸量管1 次，25 mL 容量瓶8 次。其中25 mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(25 mL)=0.000 693(見2.2.3)；不同玻璃量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表1。

表1 玻璃量器引入的不確定度

則系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不 確定度：

以上各項(xiàng)不確定度分量相互獨(dú)立，則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.4 樣品測(cè)定過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)

樣品測(cè)定過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源于紫外–可見分光光度計(jì)。由紫外–可見分光光度計(jì)校準(zhǔn)證書查得的透射比最大允許誤差為0.5%，按均勻分布(k=)，則紫外–可見分光光度計(jì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)=0.005／=0.002 887。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

按GB／T 36859–2018 配制尿素質(zhì)量濃度分別為0，0.008，0.016，0.024，0.032，0.040，0.080，0.200 mg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定3 次，結(jié)果見表2。以尿素的質(zhì)量濃度(c)為橫坐標(biāo)、420 nm 波長處的吸光度(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為A=3.852 7c+0.005 9，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。表明尿素的質(zhì)量濃度在0.008～0.020 mg／mL 范圍與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

表2 尿素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的吸光度

吸光度測(cè)定值與理論值之差的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(A)按式(2)計(jì)算：

式中：a——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率，a=3.852 7；

b——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線截距，b=0.005 9；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度點(diǎn)測(cè)定次數(shù)，n=24；

ci——尿素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，mg／mL；

Ai——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(3)計(jì)算：

式中：a——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線斜率，a=3.852 7；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度點(diǎn)測(cè)定次數(shù)，n=24；

p——重復(fù)性測(cè)定次數(shù)，p=6；

ci——尿素濃度，mg／mL。

將表2 數(shù)據(jù)代入式(2)和式(3)，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)偏差s(A)=0.009 068，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(L)=0.001 078 mg／mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)=u(L)／=0.027 500。

2.6 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

對(duì)飼料中的尿素含量分別進(jìn)行了6 次獨(dú)立測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 樣品6 次測(cè)量結(jié)果

測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(X)按式(4)計(jì)算

式中：p——重復(fù)性測(cè)定次數(shù)，p=6；

Xi——樣品中尿素含量測(cè)定值，%。測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(5)計(jì)算：

將表3 數(shù)據(jù)帶入式(4)計(jì)算測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(X)=0.050 596%，測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(R)=0.022 627%，測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)=u(R)／=0.023 089。

2.7 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上各不確定度分量相互獨(dú)立，互不相關(guān)，則飼料中尿素含量的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.8 擴(kuò)展不確定度及測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)語

基于對(duì)二甲氨基苯甲醛分光光度法測(cè)定飼料中尿素含量時(shí)，當(dāng)飼料中尿素含量為0.98%時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為0.082%(k=2)。測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度，其次為測(cè)量重復(fù)性和系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制所引入的不確定度。因此在日常分析工作中應(yīng)有針對(duì)性地采取措施，盡可能降低這幾項(xiàng)不確定度分量，以提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。