高晶，徐蓓，湯樺，何海紅

(中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

五氯硝基苯屬于有機(jī)氯殺菌劑，主要作為土壤殺菌劑和攪拌劑廣泛應(yīng)用于大棚蔬菜病菌防治，大田種子病蟲害預(yù)防［1–2］，以及一些功效植物如人參、黃芪、銀杏等的種植中。研究表明，五氯硝基苯具有生物累積性，可導(dǎo)致肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，并引發(fā)各種特異性疾病，所以世界各國對(duì)五氯硝基苯的使用進(jìn)行了限制，如瑞典、奧地利、德國等國家禁止使用該農(nóng)藥［3–6］，GB 2763–2019 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［7］和《中國藥典》2015年版中均對(duì)五氯硝基苯在食品和中藥材中的殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格的限定。因此測(cè)定食品和環(huán)境樣品中五氯硝基苯含量具有重要意義。

目前測(cè)定五氯硝基苯的方法主要依據(jù)GB／T 5009.136–2003 《植物性食品中五氯硝基苯殘留量的測(cè)定》［8］和SN／T 1957–2007 《進(jìn)出口中藥材及其制品中五氯硝基苯殘留量檢測(cè)方法 氣相色譜–質(zhì)譜法等》［9］。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為量值傳遞溯源的載體，是獲得有效結(jié)果的重要保證，但目前國內(nèi)只有五氯硝基農(nóng)藥苯純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，尚無使用便利的五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。筆者以五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為原料，采用重量–容量法制備了甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，可用于食品和環(huán)境樣品中五氯硝基苯分析方法的確認(rèn)和評(píng)價(jià)、儀器校準(zhǔn)與檢測(cè)質(zhì)量控制，為五氯硝基苯分析量值的準(zhǔn)確、可靠提供保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1100 型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平： XP26 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒公司；

五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號(hào)為GBW(E) 060617，純度為99.5%，不確定度為0.3%，k=2)，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

甲醇：HPLC 級(jí)，美國默克公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

以五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和HPLC 級(jí)甲醇為原材料，于(20±2)℃條件下，采用重量–容量法配制。稱取五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約0.201 17 g，置于2 000 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，充分混勻，靜置。在潔凈室中將制備好的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分裝于2 mL 安瓿瓶中，共分裝200支，于4℃下儲(chǔ)存。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：Inertsil ODS–3 柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，日本GL Sciences 公司)；流動(dòng)相：甲醇–水溶液(體積比為95∶5)，流量為1.0 mL／min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：5 μL；運(yùn)行時(shí)間：10 min；檢測(cè)波長：220 nm。

1.4 均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)JJF 1343–2012 《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的要求》［10］，從分裝好的200 支樣品中隨機(jī)抽取15 瓶，在1.3 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定，每瓶測(cè)定3 次，以3 次測(cè)定結(jié)果的平均值作為一瓶的測(cè)定結(jié)果，利用F 檢驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。

1.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

1.5.1 短期穩(wěn)定性

模擬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)運(yùn)輸和傳遞過程，在50℃溫度條件下進(jìn)行短期穩(wěn)定性考察。分別在第0，2，3，4，5，6，7 天隨機(jī)抽取3 瓶樣品，在1.3 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定，采用直線擬合法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行短期穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。

1.5.2 長期穩(wěn)定性

將制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于4℃下保存并進(jìn)行為期12 個(gè)月的長期穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照前密后疏的原 則［10–11］，分別在第0，2，3，4，5，6，12 個(gè)月隨機(jī)抽取7瓶樣品，在1.3 儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定，每瓶樣品測(cè)定3 次，計(jì)算平均值。每次測(cè)試均以新制備的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)儲(chǔ)存樣進(jìn)行定值，采用直線擬合法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行長期穩(wěn)定性評(píng)估。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性檢驗(yàn)

按照1.4 方法對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表1 和表2。

表1 甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

表2 單因素方差分析結(jié)果

ISO 導(dǎo)則35–2017 第7.10 條款給出了均勻性檢查的4 種方法［12］。按照其中第二種方法，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，如果能夠滿足應(yīng)用需求則判斷其均勻性合格。五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要用于食品中五氯硝基苯殘留測(cè)定，按照國標(biāo)方法［12–14］規(guī)定，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的15%，最大允許誤差為15%／2=7.5%。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度小于最大允許誤差的三分之一（即2.5%）時(shí)對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生的影響可以忽略不計(jì)，滿足預(yù)期用途。計(jì)算結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.9%，擴(kuò)展不確定度為1.8%，滿足應(yīng)用需要，由此判斷制備的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好。

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.2.1 短期穩(wěn)定性

按照1.5.1 方法對(duì)制備的五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表3。以測(cè)定日期為自變量，以五氯硝基苯含量為因變量進(jìn)行線性回歸，得直線斜率b1= –9.286×10–5，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.000 138 4，直線截距b0=0.100 1，斜率 不 確 定 度s(b1)=2.615×10–4，查 表 得t=2.57，則t·s(b1)=6.720×10–4，|b1|＜t·s(b1)，表明直線斜率不顯著，制得的甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性良好，在運(yùn)輸過程中能夠保持量值穩(wěn)定。

表3 短期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 長期穩(wěn)定性

按照1.5.2 方法對(duì)研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 長期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

以檢測(cè)月份為自變量，以五氯硝基苯含量測(cè)定平均值為因變量進(jìn)行線性回歸，得直線斜率b1=1.703×10–6，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=2.020×10–4，直線截距b0=0.099 95，斜率不確定度s(b1)=8.151×10–6，查表得t=2.57，則t·s(b1)=2.055×10–5，|b1|＜t·s(b1)，表明直線斜率不顯著，制得的甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度按式(1)計(jì)算：

式中：c——五氯硝基苯的質(zhì)量濃度，mg／mL；

m——稱量的五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，g；

p——五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，%；

V——溶液定容體積，mL。

稱取純度為99.5%的五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.201 17 g，定容體積為2 000 mL。按照公式(1)計(jì)算甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度為0.100 08 mg／mL，取3 位有效數(shù)字，最終濃度值為0.100 mg／mL。

3 不確定度評(píng)定

3.1 不確定度來源

根據(jù)公式(1)及各影響因素建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評(píng)估模型［15–20］，如式(2)所示。

式中：fC——與測(cè)量精密度相關(guān)的修正因子；

fT——與溫度相關(guān)的修正因子；

fH——與均勻性相關(guān)的修正因子；

fS——與穩(wěn)定性相關(guān)的修正因子。

由式(2)可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度主要包括三部分：（1）定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，采用重量–容量法配制溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以液相色譜法進(jìn)行量值核驗(yàn)，則定值的不確定度主要包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度u(p)、稱量質(zhì)量引入的不確定度u(m)、定容體積引入的不確定度u(V)、定值核驗(yàn)測(cè)量的重復(fù)性引入的不確定度u(fC)及溫度差異引入的不確定度u(fT)；（2）均勻性引入的不確定度分量u(fH)；（3）穩(wěn)定性引入的不確定度分量u(fS)。

3.2 不確定度分量

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(p)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果，五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的擴(kuò)展不確定度為0.3%(k=2)，則五氯硝基苯農(nóng)藥純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(p)=0.3%／2=0.15%。

3.2.2 稱量質(zhì)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)

根據(jù)稱量所使用電子天平檢定證書，0.01～5 g 天平的示值誤差為0.02 mg，重復(fù)性為0.05 mg，二者合在一起最大為0.07 mg，即占總稱量質(zhì)量0.2 g 的0.003 5%，按均勻分布，k=，因?yàn)槭? 次稱量，則稱量質(zhì)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)=0.003 5%=0.003%。

3.2.6 不均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(fH)

不均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(fH)等于均勻性檢驗(yàn)不確定度ubb，根據(jù)表2 數(shù)據(jù)，u(fH)=ubb=0.30%。

3.2.7 不穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(fS)

3.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上各不確定度分量互不相關(guān)，合成上述各不確定度分量，得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.4 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=kuc=1.8%。

4 結(jié)語

用重量–容量法制備了甲醇中五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，有效期為12 個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)值為0.100 mg／mL，擴(kuò)展不確定度為1.8%。制備的五氯硝基苯溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于蔬菜、茶葉、中藥材、土壤等中的農(nóng)藥殘留日常分析與檢測(cè)，為分析量值的準(zhǔn)確、可靠提供保障。