溫超 王靜竹 朱天碩 劉欣 王杉 張亦農(nóng)

國家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

1 引言

睪酮（testosterone，T）是人體內主要的固醇激素之一，可以促進機體的合成代謝，促進肌肉和力量的增長[1-3]，因此被某些運動員作為興奮劑使用。由于體內自身合成的睪酮和睪酮制劑中的睪酮的分子結構完全一致，常規(guī)的質譜儀難以區(qū)分體內自身合成的睪酮和外源攝入的睪酮。同時，由于個體差異、不同的生理狀況，尿樣中的睪酮濃度變化范圍較大，因此，尿樣中外源性的睪酮確證，一直以來都是興奮劑檢測領域的重點和難點[4-6]。按照世界反興奮劑機構（WADA）的規(guī)定[7，8]，當體內睪酮、表睪酮及其代謝物的濃度或者比例發(fā)生異常變化時，如睪酮和表睪酮濃度比例大于4，或者在男性尿樣中睪酮含量大于200 ng/mL 時，需要對尿樣中的睪酮以及其主要代謝物進行氣相色譜-燃燒-同位素比質譜（GC-C-IRMS）確證[7-12]，區(qū)分被分析物是否為外源性類固醇激素。

GC-C-IRMS 檢測技術在興奮劑檢測領域已經(jīng)有20年左右的應用[13-21]。通過對樣品待測物中13C/12C 的比例與內源性激素參照物中13C/12C 比例進行比較，可以判斷樣品中待測物是否為內源產(chǎn)生或外源攝入。通常13C/12C 的比例表示為δ13C 值，使用維也納Pee Dee 箭石標準（Vienna Pee Dee Belemnite，VPDB）作為國際單位進行校準[22]。

目前，大多數(shù)人工合成的類固醇激素均來自于植物基質，相對于人體自身合成的類固醇激素，人工合成的類固醇激素具有更貧乏的δ13C值[7，17，22-24]。當人體攝入外源性睪酮，其體內睪酮及其代謝物的δ13C值將隨之變化，而與睪酮代謝無關的其他類固醇激素則不受影響。在興奮劑尿樣檢測中，常采用指定一種內源性類固醇激素為內源性參照化合物（endogenous reference compound，ERC），將其的δ13C值與待測檢測目標化合物（target compound，TC）的δ13C 值進行比較，可以判斷出TC 是否與ERC 一樣為內源性產(chǎn)生。在興奮劑檢測領域，孕烷二醇（pregnanediol，PD）、11β-羥基-雄酮（11βhydroxyandrosterone，11OHAn）、5α-雄烷-16-烯-3β-醇（5α-androst-16-en-3β-ol，16en）、11-ketoetiochola?nolone（11-keto）等常被作為內源性參照化合物[7]。按WADA 技術文件規(guī)定，當ERC 和TC 的δ13C 值差（表示為Δ）大于3‰或4‰時（根據(jù)TC 種類而定），則認為該TC來自于外源性攝入。

當樣品進入GC-C-IRMS 后，先經(jīng)過氣化，然后在氣相色譜中進行分離，分離后的組分經(jīng)過燃燒管轉化為CO2后再進入同位素比質譜進行檢測，最終得到待測物質的δ13C 值。由于GC-C-IRMS 分析僅能對待測物的δ13C值進行測定，無法對待測樣品的結構信息進行確認，因此當待測物質在氣相色譜有干擾或者共流出峰時，測定的δ13C值將不準，無法用于結果判斷。所以，樣品的前處理對于GC-C-IRMS 分析極其重要。由于尿樣中基質成分復雜，而待測物睪酮及其代謝物濃度較低，如何采用高效的純化分離技術對尿樣中的待測物質進行分離提純，并測定其δ13C值，是興奮劑檢測領域中亟待解決的技術之一。目前國際常用的方法是使用兩次液相分離純化，提高分析物的純度，或通過化學衍生化手段，使分析物在氣相色譜上完全分離[9-12，23-24]，這些方法可以有效提高尿樣中待測組分的分離效率，但需要大量時間和人力進行監(jiān)測分析。

目前國際通用的方法大多基于Piper 等的兩次液相色譜純化結合衍生化法[17]。該方法先將尿樣進行酶解處理，然后進行第一次液相色譜分離，通過收集經(jīng)過液相洗脫的待測物質餾分達到分離純化作用。在經(jīng)過第一次液相分離后，將其中難以分離的待測組分，睪酮、5α-雄烷-3α，17β-二醇、5β-雄烷-3α，17β-二醇物質餾分進行乙?；磻?，將待測物質轉化為相應的乙酰化產(chǎn)物。對經(jīng)過乙?；慕M分進行第二次液相色譜分離，收集對應的餾分。經(jīng)過以上液相色譜分離的樣品可以進行GC-C-IRMS 分析。通過兩次液相分離以及衍生化反應，可以對尿樣中的睪酮及其代謝物進行純化，滿足GC-C-IRMS測試的樣品需求。該方法的兩次液相色譜分離以及衍生化反應需要大量時間以及人工操作，在大型體育比賽及樣品高峰期間，會對常規(guī)檢測工作帶來巨大壓力。同時，由于對待測物質進行衍生化后化學基團發(fā)生轉化，因此測定的δ13C值需要進行校正，該過程也會產(chǎn)生一定測量誤差。

建立高效快捷的GC-C-IRMS檢測方法，對于我國興奮劑檢測工作具有重要現(xiàn)實意義。本研究根據(jù)WA?DA的相關技術文件要求進行實驗方案設計，建立檢測方法，主要對方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及線性、不確定度、人群值等進行驗證評價，建立一套GC-C-IRMS 檢測方法，用于對尿樣中睪酮及其代謝物進行來源分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

E.coli IX-A 型β-葡萄糖醛酸甙酶購置于Sigma公司；睪酮、表睪酮（epitestosterone，ET）、孕二醇、5α-雄烷-3α，17β-二醇（5α-androst-3α，17β-diol，5α-di?ol）、5β-雄烷-3α，17β-二醇（5β-androst -3α，17β-di?ol，5β-diol）、雄酮（androsterone，An）、本膽烷醇酮（etiocholanolone，Etio）、11-β-羥基雄酮、甲基睪酮（17α-Methyltestosterone，MT）標準物質均購置于澳大利亞國家計量研究所；磷酸二氫鉀（KH2PO3）、磷酸氫二鉀（K2HPO3）、乙酸乙酯、正己烷等購置于國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、正己烷（C6H14）、乙酸乙酯（C4H8O2）、乙腈（CH3CN）、叔丁基甲醚（（CH3）3COCH3）購置于Sigma-Aldrich 公司；所用的氦氣、二氧化碳以及氧氣來自于北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司。

液相色譜采用安捷倫公司Agilent 1200 series HPLC，配有Agilent 1260 Infinity collector 系列接收器，氣相色譜-燃燒-同位素比質譜來自于賽默飛世爾科技有限公司，配置有Trace1310 系列氣相色譜儀Thermo Scientific MAT 253同位素比質譜。

2.2 本研究的實驗原理和方法

2.2.1 實驗原理

待測物睪酮及其代謝產(chǎn)物在尿樣中均以葡萄糖苷酸形式存在，此類結合形式由于沸點高等原因，無法使用氣相色譜進行分離，因此無法進行GC-C-IRMS 分析。在實際尿樣檢測中，使用β-葡萄糖醛酸甙酶將尿樣中的待測物質進行酶解，將其轉化為游離態(tài)化合物后再進行GC-C-IRMS分析[7]。

GC-C-IRMS 檢測原理為將待測物質通過氣相色譜氣化分離后，經(jīng)由燃燒管轉化為CO2，通過分析CO2中的13C/12C 的比例計算得到δ13C 值，即為待測物質的δ13C值。當待測物質中有干擾物時，會在氣相色譜中出現(xiàn)共流出峰，測定出的δ13C值為待測物和干擾物的混合值，無法進行結果判定。因此，在GC-C-IRMS 檢測過程中，樣品的前處理非常重要。雖然氣相色譜具有一定分離能力，但由于尿樣基質復雜，氣相色譜的分離能力已經(jīng)無法滿足實驗要求。尿樣中基質種類復雜，因此需要在GC-C-IRMS 分析前將尿樣中的待測組分進行分離富集，得到純度較高的樣品。在實際尿樣檢測中，通常使用液相色譜將尿樣中的待測物質進行分離純化，其原理為將尿樣中的待測組分在液相色譜柱上進行洗脫[9]，按照標準物質的保留時間，收集純化后的液相色譜餾分[6，7，9，17]。該餾分中含有純度較高的待測物質，后續(xù)經(jīng)過氣相色譜分離，可以得到純凈的氣相色譜峰，對待測物質進行δ13C值測定。

2.2.2 實驗方法

現(xiàn)將實際檢測中的樣品處理操作舉例說明。取適量尿樣，以待測物濃度100 ng/mL 的尿樣為例。取2份，每份3 mL尿樣，每份加入1 mL磷酸緩沖液（pH約為6.0～7.0），加入100μL β-葡萄糖醛酸甙酶（5000 units），55℃恒溫水浴保溫180分鐘以上或過夜，取出樣品冷卻至室溫，加入4 mL叔丁基甲基醚，振蕩萃取，離心后取上層有機相，75℃加熱下氮氣吹干，冷卻至室溫，加入65 μL含有內標MT濃度為的0.3 mg/mL的甲醇溶液，振搖后轉移至液相進樣瓶中，封口。經(jīng)過離心后靜置待用。樣品采用HPLC 分離純化。選用色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 μm×250 μm，5 μm），梯度如下：80∶20（A∶B）→15 min→50∶50（A∶B）-保持10min→8 min→10∶90（A∶B）→1min→0∶100（A∶B）-保持5min→4 min→80∶20（A∶B），平衡6 min.流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。流動相A 為水，B為乙腈。通過檢測在192和244 nm處的紫外檢測信號來對樣品收集時間以及運行穩(wěn)定性進行判斷。HPLC分離組分經(jīng)過收集后，在75℃加熱下氮氣吹干待用。使用20 μL IRMS 上機溶液進行溶解封口后進行GCC-IRMS分析。

3 結果與分析

本研究根據(jù)WADA技術文件進行實驗設計和方法驗證，以達到WADA對于GC-C-IRMS檢測的技術要求和相應指標。本方法中所有測定的δ13C值均使用可溯源標準品CU/PCC34-3 對儀器參考氣進行校準。本方法涵蓋7種物質的檢測，其中PD和11OHAn為ERC，T、5α-雄烷-3α，17β-二醇（5α-diol）、5β-雄烷-3α，17β-二醇（5β-diol）、雄酮（An）、本膽烷醇酮（Etio）為TC。在實際樣品中，T、5α-diol、5β-diol 三種物質的濃度往往低于其他的物質。

3.1 液相色譜分離

為進一步提升待測物質ERC 和TC 的純度以及對樣品進一步富集，需要在進行GC-C-IRMS 檢測前，對尿樣中的待測物質進行液相色譜分離提純，收集經(jīng)液相色譜柱分離后的各個組分的流出物，該過程可以將尿樣中的大量基質排除，有效提高待測物質的純度。尿樣通過液相色譜柱的過程中，會產(chǎn)生同位素分餾效應[25-26]，流出物的收集時間差異導致最終測定結果的δ13C 值出現(xiàn)偏差。根據(jù)WADA 技術文件要求，當Δ大于3‰或4‰時（根據(jù)TC種類而定）時可判定待測物TC為外源攝入，因此在液相色譜純化過程中一定要避免同位素分餾效應對最終結果的影響，造成假陽性或假陰性。

在方法驗證過程中，須將標準物質在液相分離前后進行對比，確認收集時間窗口內收集的樣品未受到同位素分流效應影響。圖1為標準物質經(jīng)過液相純化的色譜圖，由圖中可見，所有的待測物質，包括ERC 和TC，均可以較好分離。通過測定標準品經(jīng)過液相色譜分離前后的δ13C值的差異，可以對收集時間窗口進行評估。經(jīng)過優(yōu)化后，各物質在液相色譜出峰前0.05 min和出峰后0.12 min進行收集為最佳的液相色譜收集窗口。圖2為一份真實尿樣的液相色譜分離譜圖。實驗中使用9 mL 尿樣進行測定，由圖可知，由于尿樣中存在大量基質，液相色譜譜圖極為復雜，無法對樣品中各組分進行區(qū)分。因此前期的收集窗口確認對樣品的純化分離有重要影響。在實際樣品運行序列中，需要在序列前后分別加入標準物質對收集窗口的有效性進行確認。同時，通過使用具有紫外吸收的內標物質甲睪（MT）作為內標，監(jiān)測樣品中MT保留時間的變化，可以對樣品液相色譜運行情況進行評估。收集后的待測物質重新定容進行GC-C-IRMS 分析。通過真實尿樣的分析物濃度及其最終在GC-C-IRMS 上的信號相應進行折算，測定本方法液相分離過程的回收率在70%左右。

圖1 各分析物的標準品的液相色譜圖及時間收集窗口

圖2 真實樣品液相色譜圖

3.2 液相色譜穩(wěn)定性評價

液相色譜的保留時間穩(wěn)定性對樣品中的待測物質檢測具有較大影響，本實驗通過標準物質保留時間窗口確認，應用于尿樣中待測組分進行分離富集，因此保留時間是否穩(wěn)定對最終檢測結果至關重要。在尿樣檢測過程中，要求尿樣中內標物質的保留時間與該批次標準物質中內標在液相純化過程中的保留時間絕對差值小于0.1分鐘，以避免在待測物收集過程中產(chǎn)生的同位素分餾效應[26]。本研究提供的檢測方法具有較高穩(wěn)定性，在液相色譜柱以及液相色譜主要備件不更換的狀態(tài)下，液相色譜柱前壓波動小于10 bar，各批次中尿樣中內標物之保留時間偏離標準物質保留時間超過0.1分鐘占總樣品約為3%?？紤]到不同尿樣中基質不同，因此在實際檢測中出現(xiàn)保留時間偏差是不可避免的。當實際樣品運行中內標保留時間與該批次標準物質運行保留時間差絕對值超過0.1分鐘時，應對該樣品進行重新分析，并在收集時適當擴大收集窗口以保證待測物質可以完全收集。

3.3 儀器線性范圍測定

GC-C-IRMS 的工作原理為待測物質經(jīng)過GC分離后通過燃燒管轉化為CO2，再對產(chǎn)生的CO2進行δ13C 進行測定，即可得到待測樣品的δ13C值。在樣品經(jīng)進樣口進入氣相色譜過程中，由于不同進樣條件、進樣量，進樣濃度等都會發(fā)生同位素分餾現(xiàn)象[26]，導致測定的δ13C發(fā)生偏差，因此需要對儀器的線性條件進行評價。按照WADA技術文件要求，GC-C-IRMS方法的儀器線性評價至少要包含8 個以上進樣量，同時要求每種物質測定的δ13C 值的標準偏差（SD）須小于0.5。在本研究方法中，我們將每個標準品配制成三份不同濃度的溶液，每份溶液使用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL 進樣測試，得到一系列每種分析物在不同信號下的δ13C值。表1列出了使用標準物質對儀器線性的測定結果。根據(jù)所得到的測量結果可知，所有的檢測物質在300～5000 mV 具有穩(wěn)定的δ13C 值。因此，在實際檢測中，需要對處理后的樣品在上機前進行進一步稀釋，得到合適的濃度，在1～2.5 μL的進樣條件下樣品信號在儀器線性范圍內才能得到準確的值。

表1 GC-C-IRMS儀器線性范圍測定

3.4 檢測濃度線性范圍

由于個體差異及環(huán)境差異，不同尿樣中的TC 和ERC 濃度會有極大差別[7，12]，因此GC-C-IRMS 確證方法測定的δ13C 值不能受到尿樣中待測物質的濃度的影響。按照WADA 技術文件規(guī)定，對于同一來源的待測物在不同濃度下（例如同一人在不同時間段留取的尿樣中待測物質濃度不同）的δ13C值測定結果應一致。該評價又稱為方法的檢測濃度線性范圍。在本方法評價過程中，選取的尿樣檢測濃度可以覆蓋當前我國興奮劑檢測實驗室的常規(guī)檢測中的待測物尿樣濃度范圍。如表2所示，同一待測物質在不同的濃度下測定的δ13C值非常穩(wěn)定，測定的SD均小于0.5，表明本研究的方法可以對不同濃度的尿樣進行檢測。

表2 GC-C-IRMS的檢測濃度線性范圍

3.5 最低檢測濃度

由于GC-C-IRMS的靈敏度所限，通常需要至少15純物質進入氣相色譜柱才能得到可靠的信號，因此在常規(guī)檢測中，對于低濃度的尿樣，需要提高樣品使用量來得到穩(wěn)定的信號。根據(jù)WADA 要求，每份尿樣中的A瓶尿量不小于45 mL，B瓶尿樣量不小于30 mL。興奮劑檢測常為多個方法對不同類別興奮劑藥物同時檢測，對可疑樣品須進行確證程序，因此各檢測方法取用尿樣應盡量少，以保證其他檢測方法具有足夠檢測尿樣可用。本研究方法中最低檢測濃度是基于15 mL尿樣而測定的最小待測物質濃度。通常An 和Etio 在尿樣中濃度較高，因此本方法僅驗證了100 ng/mL 尿樣。其他的ERC 驗證了10 ng/mL 尿樣。在進行驗證過程中，分別連續(xù)三天進行三次測定，同一分析物得到三份結果。從表3的比對結果中可知，在采用15 mL尿樣分析時，使用本方法可以對含量為10 ng/mL 的PD、11OHAn、T、5α-diol、5β-diol測定δ13C值，且結果穩(wěn)定。

表3 GC-C-IRMS方法最低檢測濃度測定

3.6 不確定度

本文中方法的結合不確定度包括方法中間精密度和偏差的均方根。具體公式如下：

其中Uc為方法的不確定度，Sw為方法的中間精密度的貢獻，RMSbias為方法測量偏差貢獻。實際測定中Sw為10 份陰性質控尿樣和10 份陽性質控尿樣的測量結果的標準偏差。而方法測量偏差是通過Keeling plot進行線性擬合結果得到[7，12，17]。表4列出了不確定度的評價結果，從表中可知，所測的質控樣品Sw分別為0.5～0.7 之間，表明本方法具有較高穩(wěn)定性，所有測定的不確定度均小于1‰，滿足WADA 對于興奮劑檢測的要求。

表4 GC-C-IRMS方法不確定度測定

3.7 人群值分析

通過GC-C-IRMS方法比較尿樣中的ERC與TC的δ13C值差異，可以判斷TC是否與ERC一樣為內源性代謝產(chǎn)生。按照WADA 技術文件要求，當ERC 和TC 的Δ＞3‰或4‰時，可以判定測定的TC 為外源性攝入。在實際檢測中，需要對方法的檢測的人群值進行評價，通過測定40份陰性樣本，得到樣本的ERC和TC的Δ值和對應Δ值的SD，要求ERC 與TC 的平均Δ±2SD≤3‰。表5列出了本研究方法的人群值分析結果。如表中所示，所有的分析結果的Δ±2SD 值均小于3‰，滿足WA?DA要求，表明本方法具有極高穩(wěn)定性。

表5 GC-C-IRMS方法人群值分析

4 結論

本研究建立了一套完整的GC-C-IRMS 方法對尿樣中的睪酮及其主要代謝物的來源進行區(qū)分。尿樣經(jīng)液相色譜純化分離，進行富集，有效提高了分析物的純度，通過測定，樣品前處理回收率在70%以上。本方法在取用15 mL 尿樣的情況下，可以對10 ng/mL 的睪酮及其主要代謝產(chǎn)物進行GC-C-IRMS 檢測。不同濃度待測物的尿樣檢測結果，以及不確定度、人群值分析結果表明本方法測定結果較為穩(wěn)定，滿足WADA 對于興奮劑檢測的要求，可以適用于興奮劑檢測實驗室常規(guī)檢測以及大賽檢測。