王寶喜 ，賀松敏 ，王倩 ，張丹杰 ，江揚(yáng)陽 ，寧莉

1.河北燕達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北廊坊 065300；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300000

信號(hào)素家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和形狀的一種系統(tǒng)發(fā)育遺傳保守蛋白。最初認(rèn)為信號(hào)素在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮抑制作用，為軸突排斥蛋白，后來大量研究證實(shí)它具有調(diào)節(jié)心臟、腎臟、肺、骨骼和免疫發(fā)育的作用[1]。通過分析大量的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)信號(hào)素在心血管疾病、癌癥、骨質(zhì)疏松癥和免疫介導(dǎo)的疾病中都有調(diào)節(jié)作用[2]。已在卡爾曼氏（Kallman）綜合征和先天性巨結(jié)腸（hirschprung）患者中檢測(cè)到人Sema3A突變。信號(hào)素可分為膜結(jié)合蛋白、分泌蛋白或糖基磷脂酰肌醇連接蛋白。第3類信號(hào)素由7個(gè)分泌蛋白組成(Sema3A-3G)。在腎臟中幾種3類信號(hào)素及其受體均有表達(dá)。有關(guān)學(xué)者研究了Sema3A和Sema3C在腎臟發(fā)育中的作用，并進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)谀I小球發(fā)育和輸尿管芽分枝形態(tài)發(fā)生中的重要性。該文主要對(duì)腎小球及足細(xì)胞疾病中Sema3A的作用進(jìn)行了綜述。

Sema3A是一種分泌型的導(dǎo)向蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如脊髓損傷)部位的積累是結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)中起抑制作用，在心血管、肺和腎臟的形成等器官發(fā)生過程中起抑制作用[3]。Sema3A缺陷表示小鼠存在心臟和骨異常，以及腎小球內(nèi)皮細(xì)胞過多，輸尿管芽分支增多等腎臟血管結(jié)構(gòu)的異常，提示Sema3A在腎發(fā)育過程中可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和限制輸尿管芽的分支增多。相反，在發(fā)育過程中，強(qiáng)表達(dá)的獲得型Sema3A會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損修復(fù)障礙，腎小球發(fā)育不良，足細(xì)胞分化延遲。Sema3A亦在正常成人腎臟足細(xì)胞和集合管中表達(dá)。Sema3A信號(hào)傳導(dǎo)通過與神經(jīng)纖毛蛋白-1（neuropilin1）和神經(jīng)叢蛋白A1（plexin A1）的受體結(jié)合形成復(fù)合物介導(dǎo)的。已知這兩種受體與信號(hào)蛋白(包括VEGFR 2、Fyn、Src和整合素)在細(xì)胞特異性環(huán)境中相互作用，進(jìn)一步表明了Sema3A復(fù)雜的相關(guān)效應(yīng)通路。神經(jīng)素(neuropilins)是一種單通道跨膜蛋白，具有編碼Sema3A和VEGF 165的大胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾。Sema3A與神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合，組裝全受體復(fù)合物并釋放神經(jīng)叢自身抑制因子。神經(jīng)叢蛋白A-D包含9種保守的跨膜受體蛋白，其中Sema3A與神經(jīng)叢蛋白A1結(jié)合。神經(jīng)叢A下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜，涉及整合素和PI3K/Akt抑制，后者阻止GSK 3失活，激發(fā)與CRMPs的相互作用，從而對(duì)微管動(dòng)力學(xué)具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用；并調(diào)節(jié)Fyn磷酸化，以及Rho、RAC GTP酶激活蛋白和酪氨酸單氧化酶微管相關(guān)蛋白（Mical），對(duì)肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)和解聚分別產(chǎn)生作用[4]。

Sema3A與神經(jīng)叢蛋白A1結(jié)合在腎臟足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和輸尿管芽衍生細(xì)胞中終身表達(dá)。神經(jīng)叢蛋白A1也在同一細(xì)胞系的個(gè)體發(fā)育過程中表達(dá)。Sema3A可誘導(dǎo)足細(xì)胞膜蛋白（podocin）表達(dá)下調(diào)，從而降低去足細(xì)胞去氧腎上腺素、足細(xì)胞膜蛋白和CD2AP之間的相互作用。此外，過量的Sema3A會(huì)增加饑餓誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和在體內(nèi)發(fā)育中腎臟的凋亡。

1 Sema3A強(qiáng)表達(dá)引起腎小球疾病

研究發(fā)現(xiàn)成年小鼠被人為大劑量注射Sema3A后，可引起類似硫酸魚精蛋白引起的變化，表現(xiàn)為足突消失和蛋白尿，此病理改變具有短暫性和可逆性[5]。人為誘導(dǎo)成年小鼠足細(xì)胞中的Sema3A增強(qiáng)表達(dá)可導(dǎo)致蛋白尿，光鏡下可見系膜基質(zhì)擴(kuò)張和輕度細(xì)胞增生，透射電鏡(TEM)下可見腎小球?yàn)V過屏障3層明顯異常。事實(shí)上，Sema3A過表達(dá)會(huì)引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和相互交錯(cuò)，腎小球基底膜(GBM)增厚和分層，以及足細(xì)胞足突明顯消失。提示Sema3A過表達(dá)可誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞損傷，破壞腎小球基底膜。值得注意的是，通過轉(zhuǎn)變基因抑制Sema3A表達(dá)后，Sema3A誘導(dǎo)的白蛋白尿、足突消退、腎小球基底膜和內(nèi)皮損傷出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，這一改變進(jìn)一步證實(shí)過量Sema3A表達(dá)與腎小球疾病的因果關(guān)系，并提示該途徑可用于靶向治療。

2 Sema3A功能增強(qiáng)下調(diào)去足細(xì)胞去氧腎上腺素

為進(jìn)一步了解足細(xì)胞Sema3A過表達(dá)誘導(dǎo)小鼠腎小球疾病表型的分子基礎(chǔ)，研究人員檢測(cè)了足細(xì)胞裂孔隔膜和腎小球基底膜蛋白的表達(dá)情況。通過定量PCR、免疫組織化學(xué)和免疫印跡方法檢測(cè)Sema3A誘導(dǎo)的成年腎臟腎小球基底膜表型的變化，包括MMP 9表達(dá)增加，膠原和層粘連蛋白鏈組成的細(xì)微變化。Sema3A過表達(dá)可引起可逆性的去足細(xì)胞去氧腎上腺素下調(diào)，而足細(xì)胞膜蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化，表明去足細(xì)胞去氧腎上腺素表達(dá)下降非由于足細(xì)胞丟失所致[6]。通過WT1+核計(jì)數(shù)對(duì)每個(gè)腎小球切片中存在的足細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)也得到了證實(shí)。綜上所述，足細(xì)胞足突消退、蛋白尿和去足細(xì)胞去氧腎上腺素的可逆性表達(dá)致病機(jī)制是在足細(xì)胞沒有丟失的情況下，通過Sema3A過表達(dá)而引起：去足細(xì)胞去氧腎上腺素去表達(dá)破壞了足細(xì)胞裂孔隔膜完整，導(dǎo)致足突消失和腎小球?yàn)V過屏障通透性增加，見圖1。

3 神經(jīng)叢蛋白A1與去足細(xì)胞去氧腎上腺素相互作用

為了解Sema3A和去足細(xì)胞去氧腎上腺素信號(hào)相互作用的分子機(jī)制，研究人員分析了Sema3A信號(hào)受體神經(jīng)叢蛋白A1和去足細(xì)胞去氧腎上腺素之間的關(guān)系，因?yàn)檫@兩種蛋白都在足細(xì)胞膜上表達(dá)，并且經(jīng)證實(shí)能形成多蛋白全受體復(fù)合物。值得注意的是，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)叢蛋白A1和去足細(xì)胞去氧腎上腺素在足細(xì)胞中同時(shí)存在，并有著物理聯(lián)系。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白純化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了神經(jīng)叢蛋白A1-去足細(xì)胞去氧腎上腺素的相互作用是直接的[7]。細(xì)胞外Sema3A信號(hào)與足細(xì)胞裂孔隔膜信號(hào)復(fù)合物之間有直接聯(lián)系。Sema3A以一種自分泌的方式通過誘導(dǎo)足細(xì)胞收縮和F-肌動(dòng)蛋白的崩解從而影響足細(xì)胞的形態(tài)。足細(xì)胞的大小、性狀隨誘導(dǎo)時(shí)間和劑量而減少而變化。

圖1 Sema3A導(dǎo)致腎小球疾病致病機(jī)制Figure 1 Sema3A causes glomerular disease pathogenesis

過量的Sema3A與神經(jīng)纖毛蛋白-1結(jié)合，導(dǎo)致神經(jīng)叢蛋白A1活化后與去足細(xì)胞去氧腎上腺素相互作用，抑制細(xì)胞膜整合素，導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，內(nèi)皮損傷和腎小球基底膜分層。虛線表示其他蛋白質(zhì)相互作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A敲除也抑制整合素活性，導(dǎo)致相似的表型。

2 Sema3A抑制腎小球αvβ3整合素活性并改變足細(xì)胞形態(tài)

大量研究表明，Sema3A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)抑制整合素活性，從而負(fù)向調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)。整合素(α3,β1)及其相互作用的G蛋白(CD 151)可促使足細(xì)胞與腎小球基底膜粘附，是毛細(xì)血管循環(huán)和腎小球基底膜組裝所必需的蛋白。檢測(cè)Sema3A過表達(dá)是否影響αvβ3和β1整合素在成人腎臟中的表達(dá)和活性，能夠進(jìn)一步了解Sema3A濃度在腎臟疾病中的作用。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞在代謝過程中均有表達(dá)αvβ3整合素，它們即是Sema3A旁分泌細(xì)胞和又是自分泌效應(yīng)的靶細(xì)胞[8]。利用特異性整合素抗體或活性整合素抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)若體Sema3A的功能增強(qiáng)后可降低約50%腎小球αvβ3整合素的表達(dá)和活性，αvβ3整合素活性降低有助于觀察腎小球表型。值得注意的是，當(dāng)敲除足細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A基因后，出現(xiàn)類似的腎小球αvβ3整合素活性下降和腎小球表型。與Sma3A相似，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A是腎小球發(fā)育和維持形態(tài)所必需的一種血管生成因子，由體內(nèi)足細(xì)胞分泌。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A和Sema3A以競(jìng)爭(zhēng)的方式結(jié)合神經(jīng)叢蛋白A1，神經(jīng)叢蛋白A1作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A的共受體與Sema3A的受體結(jié)合。此外，神經(jīng)叢蛋白A1、VEGF受體整合素2和3在足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中相互作用。值得注意的是，以上現(xiàn)象發(fā)生在Sema3A過表達(dá)或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A基因敲除情況下，表明足細(xì)胞分泌的這兩種蛋白存在同一的信號(hào)通路或在獨(dú)立通路合并后下調(diào)體內(nèi)和培養(yǎng)細(xì)胞中整合素的活性[9]。綜上所述，Sema3A過表達(dá)或VEGF基因敲除導(dǎo)致αvβ3整合素活性下降，破壞了腎小球?yàn)V過屏障的完整性和功能，除了動(dòng)態(tài)和可逆(至少部分)之外，腎小球表型與整合素缺失模型相似，模擬了Sema3A或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A調(diào)控表達(dá)的病理生理變化，見圖1。

足細(xì)胞整合素活性下降可導(dǎo)致腎小球疾病，表現(xiàn)為局灶節(jié)段性腎小球硬化和腎病綜合征，二者分別由過量suPAR過表達(dá)或自分泌的B7.1上調(diào)引β整合素的激活與失活。關(guān)于Sema3A誘導(dǎo)的αvβ3整合素活性降低與B7.1導(dǎo)致足突細(xì)胞消失的機(jī)制的相關(guān)性仍無可靠證據(jù)，后者的機(jī)制是與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白破壞足細(xì)胞骨架形成。在人腎病綜合征中關(guān)于Sema3A的作用及代謝關(guān)系有待確定。

目前，Sema3A基因在人體生理中的調(diào)控作用尚不清楚，大多數(shù)報(bào)道都集中在Sema3A的下游信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)育和病理效應(yīng)上。研究顯示1型糖尿病小鼠模型中Sema3A蛋白升高，并觀察到在晚期糖尿病腎病患者的腎活檢中Sema3A蛋白表達(dá)升高(Veron&Tufro結(jié)果未公布)，提示Sema3A過表達(dá)可能參與到糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中。有證據(jù)表明，Sema3A作為免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)因子具有保護(hù)骨和抗血管生成的作用，且提示Sema3A是治療免疫疾病、骨質(zhì)疏松和癌癥的潛在靶點(diǎn)。有研究證實(shí)通過向腎細(xì)胞傳遞miR-199a-3p，下調(diào)Sema3A的表達(dá)，從而激活A(yù)KT和ERK通路，證明hBMSC-Exos具有抗凋亡作用，可以保護(hù)I/R免受損傷。這些發(fā)現(xiàn)揭示了hBMSC-Exos治療AKI的新機(jī)制，為腎臟疾病的治療提供了一種新的方法。miR-497-5p對(duì)semaphorin 3A表達(dá)具有高度抑制作用，semaphorin 3A和miR-497-5p均可被認(rèn)為是未來治療自身免疫性疾病(如多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)的治療嘗試的進(jìn)一步研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)[10-12]。因此，人們必須仔細(xì)研究Sema3A引起的腎小球疾病等非保護(hù)效應(yīng)。

綜上所述，Sema3A信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控對(duì)于維持成年小鼠的腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和功能必不可少。事實(shí)上，足細(xì)胞Sema3A信號(hào)過表達(dá)導(dǎo)致腎小球疾病[11]。已證實(shí)Sema3A可誘導(dǎo)足細(xì)胞消失、破壞腎小球足細(xì)胞完整性，并引起內(nèi)皮損傷的致病機(jī)制。即通過神經(jīng)叢蛋白A1-去足細(xì)胞去氧腎上腺素的相互作用下調(diào)去足細(xì)胞去氧腎上腺素使F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架崩解，并降低腎小球足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的αvβ3整合素活性。關(guān)于足細(xì)胞Sema3A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)叢蛋白A1下游調(diào)控研究可為腎病和糖尿病腎病提供新的分子和細(xì)胞致病機(jī)制，以及新的治療靶點(diǎn)。