趙 洋， 馮藝川， 哈 洋， 吳松權， 全雪麗

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000)

膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)為豆科多年生草本植物，國家三級瀕危保護植物，具有補氣升陽、生津養(yǎng)血、行滯通痹等功效[1]。據(jù)已有文獻報道，膜莢黃芪中的主要藥用活性成分為黃酮類、皂苷類等化合物[2-5]?！吨腥A人民共和國藥典(第一部)》[1]規(guī)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷是其主要活性指標成分之一，具有增強機體免疫力、抗炎、降血糖和保護肝臟等作用[6-9]。目前，黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的生物合成研究已成為研究熱點。

4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA lig-ase,4CL)是植物類黃酮類化合物和木質素等生物合成途徑的一種關鍵酶。據(jù)已有文獻報道，擬南芥、黑麥草、歐洲山楊、覆盆子、毛白楊、亞麻、青稞、甜高粱等多種植物中已成功克隆出了4CL基因[10-11]。此外，4CL基因既在植物生命世代初期開始由植物自身的發(fā)育調(diào)控，還能被多種誘導子及環(huán)境因子激活[12]。而有關膜莢黃芪4CL全長基因克隆的研究尚未見報道。本研究以膜莢黃芪為材料，通過RACE法克隆了4CL全長cDNA序列，并利用生物信息學和qPCR轉錄表達方法[13]對其功能進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1) 植物材料 2年生膜莢黃芪。選取一部分的根、莖、葉，用液氮冷凍處理后置于-80 ℃的超低溫冰箱中，另一部分樣品置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒定后用于成分分析。

2) 試劑及儀器 Trizol試劑，購自Invitrogen公司；合成cDNA第一條鏈的試劑盒，購自Toyobo公司；SMARTerTMRACE cDNA 5’和3’RACE試劑盒，購自Clontech公司；DNA凝膠回收試劑盒和PMD-19T載體試劑盒，購于寶生物工程(大連)有限公司；對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號110907)，購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；乙腈和甲醇為色譜級，水為超純水，其他試劑分析純，購于國內(nèi)各公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

在NCBI網(wǎng)站上搜索已經(jīng)在Genbank上登陸的豆科植物及擬南芥等模式植物的4CL的mRNA和蛋白質的完整或部分序列并下載，使用MegAlign軟件確定其保守區(qū)域后，利用Primer Premier 5.1軟件設計1對Am4CL基因的簡并引物Am4CLu1和Am4CLd1(引物的合成由上海英駿生物合成公司完成)。該試驗所用引物如表1所示。

表1 引物序列

1.2.2 總RNA提取與cDNA的合成

采用Invitrogen公司的Trizol一步法提取膜莢黃芪根總RNA，具體步驟參照其說明書，將提取的總RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱中。在150 V電壓、1.2%瓊脂糖凝膠電泳15 min和NanoDrop 2 000 C超微量分光光度計檢測其質量與濃度；按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉錄試劑盒說明書的步驟合成膜莢黃芪cDNA第1條鏈。

1.2.34CL基因保守區(qū)克隆

以合成的cDNA第1條鏈為模板，進行PCR擴增，反應體系共20.0 μL：10×PCR Buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，cDNA 1 μmol/L 2.0 μL，Am4CLu1 2.0 μL，Am4CLd1 2.0 μL，5 U ExTaq 0.2 μL，dd H2O 7.8 μL。使用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(康為世紀公司)回收PCR產(chǎn)物的DNA片段；將目的片段與pMD18-T載體在16 ℃條件下進行過夜連接；將重組質粒轉化至大腸桿菌感受態(tài)JM109；將提取的重組質粒DNA原液稀釋50倍后，使用M13引物(表1)進行PCR檢測；將PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖膠上電泳，將陽性克隆菌株進行測序。測序工作由上海英駿生物公司完成。

1.2.4 5’RACE 和 3’RACE 擴增

參照Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒說明書，分別合成目的基因片段的5’端和3’端。根據(jù) 2個4CL基因家族的保守序列分別設計1對 5’-RACE 和 3’-RACE 的特異引物Am4CLgsp1和Am4CLgsp2，引物序列如表1所示。PCR 產(chǎn)物的克隆與測序，方法同1.2.3

1.2.54CL基因編碼區(qū)的克隆

依據(jù)已經(jīng)克隆的保守區(qū)域的cDNA序列和5’-RACE 和 3’-RACE 擴增的產(chǎn)物序列，設計并合成了編碼區(qū)特異引物Am4CLcu1和Am4CLcd1，如表1所示。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物的克隆與測序，方法同1.2.3。

1.2.64CL基因的生物信息學分析

運用Lasergene軟件包中Protean預測編碼蛋白分子量和等電點；利用ProtScale(http://web.Expasy.org/protscale/)軟件進行疏水性進行分析；利用Psipred預測4CL蛋白的二級結構；利用TMHMM-2.0在線工具進行4CL蛋白序列跨膜區(qū)的預測。利用MEGA7軟件進行氨基酸序列比對分析和構建4CL氨基酸序列系統(tǒng)進化樹。

1.2.7 膜莢黃芪4CL基因的熒光定量PCR分析

針對獲得的Am4CL特異序列，設計1對熒光定量PCR引物(表1)，所用內(nèi)參基因為黃芪18s基因(表1)，進行熒光定量PCR。反應體系共20.0 μL，除了SYBR 10.0 μL和ROX 0.5 μL外，其他同1.2.3項。以標準的Am4CL和18S基因拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的CT值為縱坐標，分別繪制其標準曲線。根據(jù)未知樣品的CT值，可在各自的標準曲線中得到其樣品的拷貝數(shù)再求出內(nèi)參基因18S的相對表達量，每組樣品進行3次重復檢測。

1.2.8 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定

毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量采用HPLC方法[14]進行測定，每組樣品的提取和測定操作重復3次。

1.2.9 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件，多重比較采用Duncan新復極差法(P<0.05)，相關性分析采用Pearson相關系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 Am4CL基因全長cDNA克隆

用簡并引物進行PCR反應獲得了4CL基因cDNA片斷(圖1A)，重組質粒進行PCR鑒定得到長度約為500 bp的4CL條帶(圖1B)，將其進行測序，并將片段命名為：Am4CL-RT。

A.用簡并引物擴增的4CL基因cDNA片斷； B. Am4CL-RT 質粒PCR鑒定

將反轉錄合成的第1條鏈，使用設計的特異性引物(表1)分別進行3’-RACE和5’-RACE，電泳如圖2(A、C)，PCR鑒定如圖2(B、D)。Am4CL-3’序列長度為750 bp；Am4CL-5’序列長度為1 300 bp，初步認為Am4CL-3’和Am4CL-5’分別為膜莢黃芪4CL基因的3’端和5’端。

A.Am4CL基因3’端PCR結果；B.Am4CL -3’質粒PCR鑒定；C.Am4CL基因5’端PCR結果；D.Am4CL-5’質粒PCR鑒定

依據(jù)所克隆的膜莢黃芪苯丙烷途徑基因保守區(qū)域序列以及5′-RACE和3′-RACE擴增的產(chǎn)物序列，通過拼接獲得目的基因的全長序列并命名為Am4CL，設計編碼區(qū)序列引物如(表1)，以反轉錄的第1條鏈cDNA為模板，PCR獲得目的基因片段(圖3)，經(jīng)過回收、連接、轉化、提取重組質粒PCR鑒定。測序結果顯示和拼接序列一致。因此，確定獲得了膜莢黃芪苯丙烷途徑的4CL基因的全長。

2.2 膜莢黃芪4CL基因的序列分析

核苷酸序列和氨基酸序列分析結果表明,Am4CL的cDNA全長為1 937 bp，其中,ORF為1 641 bp，3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)為144 bp，5’非翻譯區(qū)(5’-UTR)為127 bp，以及25 bp的polyA尾。DNA序列中A+T含量為52.50 %，C+G含量為47.5%，推測其編碼546個氨基酸。

登錄NCBI主頁，用Blast在線搜索工具將Am4CL基因序列與其他植物的4CL基因序列進行對比分析。結果表明，Am4CL豆科的一些植物，比如刺毛黛豆(RDY12997.1)、百脈根(BT139278.1)、紅豆(XP_027330824.1)的相似性分別為79%、87%、81%，與豆科其他屬的相似性也很高，說明Am4CL是膜莢黃芪的4CL基因序列。

2.3 4CL的生物信息學分析

疏水性分析顯示(圖4)，Am4CL的總平均親水指數(shù)為0.009，是疏水性蛋白質。其中,疏水性最強位點在106位置，達到3.167，親水性最強位點在192位置，為-2.556。二級結構預測結果(圖5)，Am4CL蛋白的二級結構α-螺旋占34.07%，β-折疊占18.50%，無規(guī)則卷曲占47.44%。16個α-螺旋，19個β-折疊。

圖4 Am4CL蛋白序列的疏水曲線

圖5 Am4CL編碼蛋白的二級結構

用Lasergene軟件包中Protean預測Am4CL蛋白相對分子質量為59 470，等電點為8.34，酸性氨基酸48個，堿性氨基酸51個。TMHMM-2.0預測結果顯示，Am4CL為膜蛋白，產(chǎn)生了2個跨膜螺旋，其跨膜區(qū)預測位置分別位于98～120位氨基酸之間和243～265位氨基酸之間(圖6)。

圖6 Am4CL蛋白跨膜結構分析Fig.6 Transmembrane structure analysis of protein of Am4CL

為了進一步深入研究Am4CL與其他植物4CL之間的進化關系，以其推測的氨基酸序列作為分析對象，利用DNAstar軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖7)可以看出14個物種的4CL氨基酸序列被劃分為2個主支，分別為TypeⅠ、TypeⅡ。將綠豆變種(XP_014504631.1)、小豆(XP_017430152.1)、菜豆(XP_007160602.1)、大豆(XP_00354004.1)、刺毛黛豆(RDY12997.1)、紅豆(XP_027330824.1)、花生(XP_025636299.1)、膜莢黃芪(ATY39971.1)歸為Ⅰ類；將紫花苜蓿(AET02374.1、XP_024627525.1、XP_013466211.1)、鷹嘴豆(XP_004499325.1)、地下三葉草(GAU12224.1)、紅車軸草(PNY04116.1)歸為Ⅱ類。

圖7 植物4CL的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 膜莢黃芪Am4CL基因表達量分析

運用實時熒光定量PCR技術，分析了膜莢黃芪植株根、莖、葉3個不同組織中Am4CL的表達特性(圖8)結果表明，Am4CL在根、莖、葉中均表達，但表達量明顯存在差異，其中，根中表達量最高，是莖中表達量的2.20倍，是葉中表達量的2.01倍。另測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在膜莢黃芪的根、莖、葉中的表達量也存在顯著差異，其中，根中含量達到了0.29 mg/g，是莖中含量(0.20 mg/g)的1.45倍，而葉中僅含有0.11 mg/g。

圖8 不同組織中4CL基因相對表達量及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

3 討論與結論

苯丙烷類代謝途徑是植物體次生代謝中的一個通用途徑，在植物生長發(fā)育中具有重要的作用[15]。4CL是植物苯丙烷類代謝途徑的一種關鍵酶，主要參與木質素和類黃酮合成。Kutsuki等[16]于1981年首次證明，4CL是木質素生物合成途徑中的一種酶。馮春燕[17]對幾種植物的4CL蛋白比對分析發(fā)現(xiàn)，4CL蛋白家族主要與木質素和類黃酮類物質的合成相關,發(fā)現(xiàn)大豆的4CL蛋白主要參與了黃酮類物質的合成。羅睿雄等[18]在芒果果實的研究表明，4CL基因可能參與了黃酮類物質的合成，其基因表達與芒果果實著色也具有密切的相關性。Chowdhury等將紅麻進行重力脅迫處理，發(fā)現(xiàn)與木質素形成的Hc4CL基因有顯著上調(diào)[19]。本研究借鑒前人的方法和經(jīng)驗，首次從膜莢黃芪中克隆了4CL基因全長序列，用生物信息學軟件進行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)與其他植物中4CL基因有極高的同源性。

運用實時熒光定量 PCR技術對膜莢黃芪中的4CL基因做進一步的研究，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)Am4CL基因在膜莢黃芪的根、莖、葉中均有穩(wěn)定表達，且根中相對表達量均高于莖和葉，這說明其在根中表達活躍，與白及[20]、丹參[21]等藥用植物的研究結果一致，這對以根為藥用部位的膜莢黃芪來說具有重要的指示意義。此外還發(fā)現(xiàn)，4CL基因在膜莢黃芪的根、莖、葉中的表達趨勢與根、莖、葉中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量趨于一致(圖8)，證明Am4CL參與毛蕊異黃酮葡萄糖苷的合成。雖然系統(tǒng)進化樹(圖7)基本按照不同物種分類，但不同物種氨基酸序列的相似性均在77%以上，已有研究表明，豆科植物的4CL蛋白參與了黃酮類物質的合成，推測克隆的Am4CL參與了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的生物合成。