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        不同臨床病理特征非小細(xì)胞肺癌中miR-1269 的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞周期的靶向調(diào)控作用

        2020-11-22 10:03:58詹莉瓊盧晏民崔杰
        安徽醫(yī)藥 2020年11期
        關(guān)鍵詞:肺癌

        詹莉瓊,盧晏民,崔杰

        作者單位:商丘市第一人民醫(yī)院,a呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,b腫瘤三科,河南 商丘476000

        肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)位居首位,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型,我國NSCLC 的發(fā)病率也呈成年升高的趨勢,但早期診斷率并不高、多數(shù)病人就診時(shí)已達(dá)中晚期并錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)[1-2]。雖然近年來分子靶向藥物的不斷問世使NSCLC 病人的生存情況得到改善,但病人的長期生存率仍較低,亟需探尋新的治療靶點(diǎn)。miR-1269 是具有促癌特性的miR,已經(jīng)在肝癌細(xì)胞和肺癌細(xì)胞中被證實(shí)能夠靶向抑癌基因FOXO1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[3-4]。FOXO1在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑癌作用,能夠靶向抑制細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1的表達(dá)、增加細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控分子p21Cip1、p27Kip1的表達(dá),進(jìn)而使細(xì)胞周期發(fā)生停滯[5-7]。但是,miR-1269 在NSCLC 病灶內(nèi)的變化及其與細(xì)胞周期的調(diào)控作用均未明確。為此,本研究具體分析了不同病理特征非小細(xì)胞肺癌中miR-1269 的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞周期的靶向調(diào)控作用。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 收集2015年3月至2018年12月商丘市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的NSCLC 病灶和對(duì)應(yīng)的癌旁病灶 58 例,其中男性 32 例、女性 26 例,年齡(51.31±8.42)歲,年齡范圍為41~64 歲。入組標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)術(shù)后病理診斷為NSCLC;(2)臨床資料完整;(3)術(shù)前未接受過放化療。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病人或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

        1.2 細(xì)胞及試劑 miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒購自北京天根公司,肺癌A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞資源中心,miR-1269的模擬物和抑制物購自上海吉瑪公司,蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司,CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的單克隆抗體購自Abcam公司。

        1.3 儀器 光定量PCR 儀購自Bio-rad 公司,細(xì)胞培養(yǎng)箱和高速離心機(jī)購自Thermo公司,倒置顯微鏡購自Nikon公司,凝膠成像儀購自上海天能公司。

        1.4 miR-1269表達(dá)量的檢測 取NSCLC病灶和癌旁病灶,采用miRNA 提取試劑盒進(jìn)行操作、提取組織中的miRNA,采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行操作、將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;采用miRNA熒光定量PCR 檢測試劑盒配置應(yīng)該定量PCR 反應(yīng)體系,對(duì) cDNA 中的 miR-1269 及 U6 進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)曲線及循環(huán)閾值、以U6為內(nèi)參、計(jì)算miR-1269的表達(dá)量。

        1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 A549細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM在培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng),細(xì)胞鋪滿底面90%后用0.125%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代,得到足夠數(shù)量的細(xì)胞后接種在培養(yǎng)板中并進(jìn)行分組處理??瞻讓?duì)照組用DMEM 處理,NC 模擬物組轉(zhuǎn)染NC 模擬物、miR-1269模擬物組轉(zhuǎn)染miR-1269模擬物、NC抑制物組轉(zhuǎn)染NC 抑制物、miR-1269 抑制物組轉(zhuǎn)染miR-1269抑制物。

        1.6 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的檢測 采用蛋白裂解液提取NSCLC病灶、癌旁病灶、轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中的蛋白,經(jīng)BCA試劑盒測定總蛋白含量后取30~50μg總蛋白進(jìn)行檢測,將蛋白樣本加入預(yù)先配置好的聚丙烯酰胺凝膠中,電泳后將凝膠中的蛋白樣本電轉(zhuǎn)移至NC 膜,用5%脫脂牛奶在室溫封閉NC 膜2 h,洗膜3 遍后用 CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的單克隆抗體在4 ℃孵育NC膜過夜;第二天,洗膜3遍后用第二抗體在室溫孵育NC 膜2 h,最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶,根據(jù)條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 軟件錄入數(shù)據(jù)。兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn),配對(duì)組間比較行配對(duì)t檢驗(yàn),多組間比較行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同病理特征非小細(xì)胞肺癌中miR-1269表達(dá)的變化 SCLC病灶中miR-1269的表達(dá)量明顯高于癌旁病灶(P<0.05);低未分化NSCLC 病灶中miR-1269 的表達(dá)量明顯高于高中分化NSCLC 病灶(P<0.05);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 病灶(P<0.05);有脈管浸潤的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達(dá)量明顯高于無脈管浸潤的NSCLC 病灶(P<0.05);有胸膜侵犯的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達(dá)量明顯高于無胸膜侵犯的NSCLC 病灶(P<0.05)。見表1。

        表1 不同病理特征非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中miR-1269表達(dá)的變化

        2.2 肺癌中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化及其與miR-1269 的相關(guān)性 NSCLC 病灶中 CyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)量明顯高于癌旁病灶,p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量明顯低于癌旁病灶(P<0.05);NSCLC病灶中miR-1269 的表達(dá)量與 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表達(dá)量呈正相關(guān),與p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。見圖1、表2。

        表2 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病灶及癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的比較/

        表2 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病灶及癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的比較/

        注:配對(duì)t檢驗(yàn),CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

        p21Cip1p27Kip1例數(shù)58 58組織來源癌旁NSCLC t 值P 值CyclinD1 0.58±0.10 0.31±0.07 15.527 0.000 CDK4 1.09±0.22 0.52±0.07 17.037 0.000 CDK6 0.73±0.16 0.25±0.05 22.318 0.000 0.52±0.08 0.70±0.13 8.282 0.000 0.58±0.09 0.85±0.15 6.895 0.000

        圖1 非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病灶及癌旁病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白的條帶圖 圖2 空白對(duì)照組、NC模擬物、miR-1269模擬物組細(xì)胞周期蛋白的條帶圖 圖3 空白對(duì)照組、NC抑制物組、miR-1269抑制物細(xì)胞周期蛋白的條帶圖

        2.3 miR-1269 模擬物和抑制物對(duì)A549 細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) miR1269 模擬物組A549細(xì)胞中CyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、NC 模擬物組,p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組、NC 模擬物組(P<0.05);miR1269 抑制物組 A549 細(xì)胞中 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組、NC 抑制物組,p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組、NC抑制物組(P<0.05)。見圖2,3;表3,4。

        3 討論

        miR-1269是具有促癌特性的miR-1269,已經(jīng)被證實(shí)在肝癌病人外周血及肝癌病灶內(nèi)均呈高表達(dá)的趨勢[8-9];另有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),miR-1269對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有促進(jìn)作用[4]。在本研究中,NSCLC 病灶內(nèi)miR-1269 的表達(dá)量明顯升高,結(jié)合miR-1269在體外促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的活性分析認(rèn)為,miR-1269的高表達(dá)與NSCLC的發(fā)生有關(guān)且病灶內(nèi)高表達(dá)的miR-1269 能夠通過改變癌細(xì)胞的生物學(xué)行為來促進(jìn)腫瘤病理進(jìn)程的發(fā)展。本研究進(jìn)一步對(duì)不同病理特征NSCLC 病灶內(nèi)miR-1269 表達(dá)量的變化進(jìn)行了分析,低未分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管浸潤、有胸膜侵犯的NSCLC病灶中miR-1269的表達(dá)量明顯升高,說明NSCLC 病灶內(nèi)高表達(dá)的miR-1269能夠使腫瘤病理特征發(fā)生惡化,分化程度明顯降低且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、胸膜侵犯。

        表3 miR-1269模擬物對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)(n=5,)

        表3 miR-1269模擬物對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)(n=5,)

        注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與NC模擬物組比較,bP<0.05,CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

        組別空白對(duì)照組NC 模擬物組miR-1269 模擬物組F 值P 值p27Kip1 0.66±0.13 0.71±0.12 0.32±0.05ab 19.985 0.000 CyclinD1 0.48±0.06 0.51±0.07 0.77±0.15ab 12.306 0.001 CDK4 0.85±0.14 0.89±0.15 1.21±0.19ab 8.157 0.006 CDK6 0.50±0.07 0.48±0.05 0.71±0.09ab 15.710 0.001 p21Cip1 0.73±0.14 0.77±0.08 0.45±0.05ab 16.000 0.000

        表4 miR-1269抑制物對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)(n=5,)

        表4 miR-1269抑制物對(duì)A549細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)(n=5,)

        注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與NC模擬物組比較,bP<0.05,CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

        組別空白對(duì)照組NC 抑制物組miR-1269 抑制物組F 值P 值p27Kip1 0.71±0.13 0.73±0.11 1.13±0.18ab 13.713 0.001 CyclinD1 0.71±0.12 0.77±0.11 0.32±0.05ab 30.879 0.000 CDK4 0.80±0.12 0.83±0.14 0.33±0.07ab 30.321 0.000 CDK6 0.73±0.12 0.79±0.13 0.41±0.08ab 16.605 0.000 p21Cip1 0.33±0.05 0.36±0.07 0.84±0.14ab 45.500 0.000

        miRs 是一類不具備編碼蛋白質(zhì)功能的小分子RNA,通過結(jié)合靶基因mRNA 來使mRNA 降解或阻礙mRNA 翻譯,進(jìn)而改變靶基因表達(dá)水平并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[10-11]。FOXO1 是 miR-1269 的靶基因之一,該基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控,一方面通過抑制cyclinD1 的表達(dá)并阻礙cyclinD1 與CDK4、CDK6的結(jié)合來使細(xì)胞周期停滯[12-13],另一方面增加p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)并增強(qiáng)兩種分子對(duì)細(xì)胞周期的阻礙作用,兩方面共同起效并實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的抑制[14-15]。在本研究中,細(xì)胞周期正性調(diào)控分子cyclinD1、CDK4、CDK6在NSCLC病灶內(nèi)表達(dá)增多且與miR-1269 呈負(fù)相關(guān),而細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控分子p21Cip1、p27Kip1在 NSCLC 病灶內(nèi)表達(dá)減少且與 miR-1269呈正相關(guān),說明細(xì)胞周期蛋白在NSCLC病灶內(nèi)發(fā)生顯著變化且這一變化可能受到miR-1269 的調(diào)控,miR-1269 通過靶向抑制FOXO1 的表達(dá)來削弱FOXO1對(duì)細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控作用,進(jìn)而使NSCLC病灶內(nèi)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)發(fā)生變化。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-1269 在NSCLC 病灶內(nèi)對(duì)cyclinD1、CDK4、CDK6 及 p21Cip1、p27Kip1等細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控作用,本研究在以上臨床樣本研究的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了細(xì)胞實(shí)驗(yàn),在培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549 后將miR-1269的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞,分別實(shí)現(xiàn)miR-1269生物學(xué)效應(yīng)的增強(qiáng)及抑制,通過分析模擬物和抑制物對(duì)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響來反應(yīng)miR-1269對(duì)細(xì)胞周期表達(dá)的調(diào)控作用。在轉(zhuǎn)染miR-1269模擬物后,A549細(xì)胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)明顯增多,而p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)明顯減少;在轉(zhuǎn)染miR-1269 抑制物后,A549 細(xì)胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)明顯減少,而p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)明顯增多。以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究表明,miR-1269能夠靶向調(diào)控肺癌細(xì)胞中多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá),使細(xì)胞周期正性調(diào)控分子cyclinD1、CDK4、CDK6 的表達(dá)增多,而細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控分子p21Cip1、p27Kip1的表達(dá)減少。

        綜上所述,miR-1269在NSCLC中呈顯著高表達(dá)趨勢且高表達(dá)的miR-1269 與NSCLC 病理特征的變化、細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化均密切相關(guān);miR-1269 能夠在體外細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。今后可進(jìn)一步設(shè)計(jì)NSCLC荷瘤小鼠,抑制miR-1269表達(dá)后觀察腫瘤的生長情況,進(jìn)而探究抑制miR-1269在NSCLC治療中的潛在價(jià)值。

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