江旭林，范星，湯俊，陳校力，嚴(yán)偉，羅慶偉，李志紅

作者單位：鄂州市中心醫(yī)院胃腸外科，湖北 鄂州436000

近年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐漸增高、年輕化趨勢。肝轉(zhuǎn)移是其治療難點(diǎn)及死亡的主要原因之一，減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生，有利于提高病人的生活質(zhì)量和生存率［1-2］。免疫治療是結(jié)直腸癌的一種治療方式，其主要是通過調(diào)節(jié)人免疫細(xì)胞來抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞防止其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，加快機(jī)體恢復(fù)［3］。白細(xì)胞介素 22（interleukin 22，IL-22）是由 Th1、Th17、Th22 等多種免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，研究表明IL-22 在結(jié)腸癌組織及血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，其介導(dǎo)的相關(guān)通路與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)［4］。還有研究發(fā)現(xiàn)具核梭桿菌可以增高IL-22 的表達(dá)，它們可協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展［5］。有研究報(bào)道磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）參與調(diào)控結(jié)直腸癌的進(jìn)展，Toll 樣受體2（TLR2）通過PI3K/AKT通路促進(jìn)結(jié)腸癌的遷移、侵襲［6］。五味子乙素通過抑制PI3K/AKT 信號通路抑制大腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］。然而IL-22 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及其機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-22 是否通過PI3K/AKT信號通路影響結(jié)腸癌的進(jìn)展，為結(jié)直腸癌的免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和組織來源 結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。結(jié)腸癌組織和正常癌旁組織：收集鄂州市中心醫(yī)院2017年1月至2019年1月接收的經(jīng)病理診斷為結(jié)腸癌的病人67例，經(jīng)手術(shù)獲取結(jié)腸癌組織和正常癌旁組織，組織標(biāo)本切除后經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。所有病人術(shù)前均未接受放化療，均知情且同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，貨號23400-021）；重組人IL-22（南京賽泓瑞生物科技有限公司，貨號SHR-328）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒（美國 ScienCell 公司，貨號8028）；BCA 試劑盒（上海吉至生化科技有限公司，貨號PC0020）；蛋白提取試劑盒（貨號P0033）與SDSPAGE 試劑盒（貨號P0690）均購于碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell 小室（貨號354480）與Matrigel（貨號354234）均購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞用10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)；用濃度分別為10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L 的重組人IL-22 處理SW480細(xì)胞，以未經(jīng)任何處理的SW480細(xì)胞作為對照組；40 μg/L 的重組人IL-22 處理SW480 細(xì)胞后再用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002處理作為IL-22+LY294002組。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測 取正常癌旁組織、結(jié)腸癌組織石蠟切片分別進(jìn)行脫蠟水化、抗原修復(fù)，滅活過氧化物酶，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌；胎牛血清封閉，加入兔抗人IL-22一抗孵育2 h，加入山羊抗兔二抗孵育30 min；3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）染色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明、封片，熒光顯微鏡觀察拍照。IL-22 陽性表達(dá)判定以細(xì)胞膜呈棕黃色和棕褐色、細(xì)胞質(zhì)呈紅色為準(zhǔn)。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，經(jīng)過脫脂牛奶封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，后加入二抗室溫孵育2 h；暗室中曝光顯影，定影；用Quantity One凝膠軟件檢測蛋白條帶吸光度（OD），以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 MTT 法測定細(xì)胞增殖率 取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，按MTT 試劑盒說明操作，在酶標(biāo)儀測定490 nm 處 OD 值。細(xì)胞增殖率（%）＝OD實(shí)驗(yàn)組值/OD對照組值×100%。

1.2.5 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞無血清培養(yǎng)后接種于Transwell 小室上室（3×103個(gè)/孔），下室加入含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行固定、染色，顯微鏡下拍照并計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用Matrigel 包被Transwell小室上室，之后同細(xì)胞遷移操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，兩組比較進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中IL-22的表達(dá) 與正常癌旁組織IL-22 陽性細(xì)胞表達(dá)率（28.35±4.21）%相比，結(jié)腸癌組織中IL-22陽性細(xì)胞表達(dá)率（76.12±8.47）%呈高表達(dá)（t＝41.340，P＜0.001）。

2.2 不同濃度IL-22 對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，不同濃度IL-22 組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中細(xì)胞增殖核抗原Ki67表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）（圖1、表1）?？梢姡琁L-22促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖。

圖1 不同濃度白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞細(xì)胞增殖核抗原Ki67蛋白表達(dá)的影響

表1 不同濃度白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響/

表1 不同濃度白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響/

注：Ki67屬細(xì)胞增殖核抗原。與對照組比較，aP＜0.05

組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值重復(fù)次數(shù)9999細(xì)胞增殖率/%0.00±2.06 36.72±5.47a 115.67±10.48a 166.42±11.81a 720.225＜0.001 Ki67 0.42±0.05 0.77±0.08a 0.84±0.11a 0.98±0.12a 57.720＜0.001

2.3 IL-22 對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對照組相比，10 μg/L、20 μg/L、40μg/L 三種不同濃度IL-22處理的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平升高，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)升高（P＜0.05）（圖2、表2）?？梢?，IL-22促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移和侵襲。

圖2 白細(xì)胞介素22（IL-22）對各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）蛋白表達(dá)的影響

2.4 IL-22對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞EMT 的影響 與對照組相比，不同濃度IL-22 組結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平降低，Vimentin、N-cadherin表達(dá)水平升高（P＜0.05）（圖3、表3）?？梢?，IL-22 促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞EMT。

2.5 IL-22 對結(jié)腸癌 SW480 細(xì)胞 PI3K/AKT 通路的影響 與對照組相比，不同濃度IL-22 組結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞中p-AKT、total-AKT 表達(dá)水平升高（P＜0.05）（圖4、表4）?？梢姡琁L-22可激活結(jié)腸癌SW480細(xì)胞PI3K/AKT信號通路。

表2 白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

表2 白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

注：MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2。與對照組比較，aP＜0.05

重復(fù)次數(shù)9999組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)80.96±6.53 123.79±8.64a 163.79±11.85a 223.79±15.72a 263.230＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)57.35±7.83 94.65±11.13a 134.71±9.54a 154.27±12.78a 152.287＜0.001 MMP-2 0.46±0.03 0.71±0.06a 0.94±0.07a 1.25±0.08a 257.772＜0.001

圖3 各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)鈣黏附蛋白（N-cadherin）的表達(dá)

表3 白細(xì)胞介素22（IL-22）對上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)鈣黏附蛋白（N-cadherin）表達(dá)的影響/

表3 白細(xì)胞介素22（IL-22）對上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)鈣黏附蛋白（N-cadherin）表達(dá)的影響/

注：與對照組比較，aP＜0.05

重復(fù)次數(shù)9999組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值E-cadherin 0.42±0.05 0.31±0.04a 0.19±0.03a 0.15±0.04a 81.591＜0.001 Vimentin 0.39±0.03 0.45±0.05a 0.61±0.05a 0.77±0.08a 85.366＜0.001 N-cadherin 0.45±0.03 0.51±0.06a 0.58±0.07a 0.71±0.08a 28.462＜0.001

圖4 各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）和總蛋白激酶B（total-AKT）蛋白表達(dá)

2.6 LY294002 逆轉(zhuǎn) IL-22（40 μg/L）對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對照組相比，IL-22 組結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞中Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平升高，E-cadherin 表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖率和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05）；與 IL-22 組相比，IL-22+LY294002 組結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞中Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin 表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖率和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）（圖5、表5）。

表4 白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路蛋白表達(dá)的影響/

表4 白細(xì)胞介素22（IL-22）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路蛋白表達(dá)的影響/

注：p-AKT為磷酸化蛋白激酶B，total-AKT為總蛋白激酶B。與對照組比較，aP＜0.05

total-AKT蛋白0.56±0.05 0.63±0.04a 0.68±0.06a 0.72±0.05a 16.794＜0.001組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值重復(fù)次數(shù)9999 p-AKT蛋白0.28±0.03 0.42±0.05a 0.58±0.06a 0.66±0.08a 76.925＜0.001

圖5 各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞細(xì)胞增殖核抗原Ki67、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經(jīng)鈣黏附蛋白（N-cadherin）的表達(dá)

3 討論

免疫治療能延緩結(jié)腸癌術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，可有效提高病人的免疫功能，是結(jié)腸癌新的輔助治療手段［8］。IL-22是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，在惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞通過釋放IL-22 活化宮頸癌細(xì)胞內(nèi)AKT 通路促使其增殖［9］。IL-22可通過促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖而促進(jìn)小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展［10］。IL-22 還能促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［11］。IL-22 通過靶向人類結(jié)腸癌細(xì)胞中的己糖激酶-2來促進(jìn)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的需氧糖酵解［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中IL-22表達(dá)顯著升高，提示IL-22可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用不同濃度的IL-22處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖率顯著升高，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著升高。表明IL-22可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Ki67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原，與腫瘤細(xì)胞的增殖相關(guān)［13］。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 均是EMT的標(biāo)志物，Vimentin、N-cadherin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)可使細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力［14-15］。MMP-2 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，下調(diào)表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL-22處理的結(jié)腸癌細(xì)胞中Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步表明IL-22可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。提示，IL-22 參與了結(jié)腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，與結(jié)腸癌的進(jìn)展有關(guān)。

表5 PI3K/AKT通路抑制劑逆轉(zhuǎn)白細(xì)胞介素22（IL-22）（40μg/L）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

表5 PI3K/AKT通路抑制劑逆轉(zhuǎn)白細(xì)胞介素22（IL-22）（40μg/L）對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移、侵襲的影響/

注：MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶2，E-cadherin為上皮鈣黏附蛋白，Vimentin為波形蛋白，N-cadherin為神經(jīng)鈣黏附蛋白。與對照組比較，aP＜0.05；與IL-22組比較，bP＜0.05

N-cadherin 0.42±0.05 0.68±0.07a 0.55±0.06b 41.482＜0.001組別對照組IL-22 組IL-22+LY294002 組F 值P 值重復(fù)次數(shù)999細(xì)胞增殖率/%0.00±4.68 216.64±17.36a 141.69±13.58b 643.739＜0.001遷移細(xì)胞數(shù)/個(gè)93.47±8.34 246.19±18.56a 147.64±12.52b 283.585＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)61.49±7.06 148.46±13.48a 97.45±11.68b 140.132＜0.001 Ki67 0.45±0.05 0.94±0.09a 0.68±0.07b 104.690＜0.001 MMP-2 0.49±0.05 1.13±0.11a 0.74±0.08b 133.757＜0.001 E-cadherin 0.53±0.05 0.19±0.03a 0.33±0.04b 157.680＜0.001 Vimentin 0.41±0.04 0.75±0.08a 0.54±0.08b 55.188＜0.001

IL-22 還可通過調(diào)控多種信號通路影響腫瘤進(jìn)展。如IL-22 通過活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480 和SW620 的增殖［17］；IL-22 通過 STAT3 激活促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲［18］。IL-22 通過 IL-22 受體 1（IL-22R1）/STAT3和IL-22R1/AKT信號通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和遷移［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-22處理的結(jié)腸癌細(xì)胞中p-AKT和total-AKT表達(dá)水平升高，說明IL-22可激活PI3K/AKT信號通路。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002 和 IL-22 共同處理結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖率以及細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低，Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin表達(dá)水平顯著升高。說明抑制PI3K/AKT通路可逆轉(zhuǎn)IL-22對結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的促進(jìn)作用。提示，IL-22 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響可能是通過PI3K/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，IL-22 可能通過PI3K/AKT 通路促進(jìn)SW480細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。