李秋月，韋東來，賀尚文，張 慧，侯思魯，徐媛媛，穆 祥，董 虹

(北京農(nóng)學院 動物科學技術學院，獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京102206)

脂多糖(Lipo-polysaccharide，LPS)，可引起全身性炎癥反應和嚴重的敗血癥，常用于制造各種炎癥模型，誘發(fā)機體炎癥反應[1, 2]。研究表明，注射LPS后會影響雞空腸緊密連接蛋白和粘蛋白的表達，損傷腸道的滲透性和屏障功能[3]，降低小腸的濕重，腸絨毛高度和小腸吸收能力[4]。目前常用的治療方法就是使用抗生素，但在牲畜日糧中過量的使用抗生素會導致越來越多耐藥菌的出現(xiàn)。

白薇最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其主要由白薇素、多糖苷等組成，具有解毒療皰，退熱抗炎等功效[5, 6]。含白薇的清營解表藥物，可以緩解患有病毒性流感小鼠的癥狀，肺部組織病理變化，巨噬細胞的吞噬功能和小鼠淋巴細胞的增殖能力[7]。利用白薇替代抗生素后可增強肉雞的生長性能，增加其心、肝、脾的抗氧化能力和腸道微生物的菌群豐富度[8]。白薇還可以降低小鼠耳廓腫脹的程度[9]。故本試驗使用LPS造炎癥模型，考察通過白薇水煎液預處理后對LPS引起的炎癥的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

LPS購于Sigma公司；白薇購于北京同仁堂；SAA、OVT、AGP、IL-1β試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；2日齡健康肉雞購于北京愛撥益加家禽育種有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組及給藥 將60只2日齡肉雞分為生理鹽水組，LPS組，白薇水煎液(3、6、9 g/kg)組。適應性喂養(yǎng)至28日齡。開始灌服給藥，每天1次，連續(xù)3 d。于第3 天灌胃前3 h按2 mg/kg劑量腹腔注射大腸桿菌LPS。

1.2.2 樣本采集 于腹腔注射3 mg/kg的LPS，12 h后采取雞翅隱靜脈采血分離血清備用。剖取十二指腸剪成1 cm左右的組織塊，用4%的甲醛固定備用。

1.2.3 指標檢測 用ELISA試劑盒檢測雞血清中SAA、OVT、AGP、IL-1β的濃度，各指標具體操作按照說明書進行。

試驗結果采用Graphpad Prism8.2.1統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)采用±標準差表示。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果分析

2.1 病理組織切片結果

從小腸HE染色切片中可以觀察到，生理鹽水組中，小腸絨毛組織結構完整，黏膜上皮細胞排列整齊(圖1-A)。LPS導致雛雞小腸絨毛黏膜上皮組織結構損傷，上皮細胞脫落并伴有炎性細胞浸潤，且固有層出現(xiàn)炎癥鈣化灶(圖1-B)，通過組織切片可以觀察到白薇水煎液(3、9 g/kg)組 (圖1-C，E)對LPS損傷的小腸絨毛起到了保護作用，但白薇水煎液(6 g/kg)組(圖1-D)保護小腸絨毛的效果最好。

圖1 病理組織切片HE染色

2.2 白薇水煎液對LPS誘導的雞血清中炎癥因子表達的影響

從圖2可知，白薇水煎液(3 g/kg)組可降低LPS刺激后SAA表達水平(P<0.05)。白薇水煎液(9 g/kg)組可降低LPS刺激后AGP的表達水平(P<0.01)。而白薇水煎液(6 g/kg)組可有效降低LPS所導致的SAA(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)、OVT(P<0.05)、AGP(P<0.001)這4種炎性因子的表達。故由試驗可知，白薇水煎液(6 g/kg)組，可降低LPS所導致的SAA、IL-1β、OVT、AGP這4種炎性因子的表達水平。

圖2 不同處理組SAA、IL-1β、OVT、AGP的ELISA試劑盒測試結果

3 討論與結論

腸黏膜在抵抗感染，調(diào)節(jié)外源抗原引起的免疫反應中起著重要的作用。腸道屏障的功能主要取決于腸道上皮的完整性，完整的腸道屏障可以阻止腸道細菌轉(zhuǎn)移到機體當中[10]。LPS和腸道細菌等促炎性細胞因子的入侵會損害腸道黏膜的通透性和完整性，引起巨噬細胞活化并促進IL-1β及一系列的細胞因子含量的增加，進而導致動物體內(nèi)SAA、AGP和OVT的變化。在雞中發(fā)現(xiàn)SAA、AGP和OVT在應激或疾病的狀態(tài)下與健康時相比存在差異[11]。在細菌或病毒感染后可觀察到雞血清中AGP的含量升高[12]。在雞傳染性支氣管炎病毒中SAA呈現(xiàn)高表達[13]。禽流感病毒感染早期或用LPS刺激時可觀察到OVT蛋白在雞血清中的含量顯著增加[14,15]。

細胞的緊密連接對于維持胃腸道屏障的完整性尤為重要，腸道病原體通過改變細胞骨架或特定的緊密連接蛋白來破壞細胞間的緊密連接[16]。大量研究表明，清熱類的中藥可以通過保護雞腸黏膜中淋巴細胞和杯狀細胞，來維持腸道屏障的完整性，從而達到保護機體的目的[17]。清熱解毒類中草藥黃連中的主要成分小檗堿可預防LPS對大鼠回腸絨毛的損傷，阻止LPS對于腸道緊密連接和腸道屏障通透性的破壞，并降低TLR4和NF-κB的活化和IL-1β的表達[18, 19]。清熱燥濕類中草藥黃芩中的主要成分黃芩苷預處理可降低大鼠結腸炎中炎性細胞浸潤和外周血單核細胞數(shù)量降低腸道的損傷。其機制是通過抑制LPS誘導的M1巨噬細胞極化，并使巨噬細胞在體外轉(zhuǎn)換為M2表型，通過調(diào)節(jié)巨噬細胞亞群來抑制炎癥，從而減輕大鼠潰瘍性結腸炎的癥狀[20,21]。清熱類中藥疏風解毒膠囊可以降低動物中SAA的含量的表達[22, 23]。因此本試驗使用清熱解毒中藥白薇水煎液，用LPS制造雞腹瀉模型，研究白薇水煎液對于LPS導致的雞腹瀉的影響，結果表明白薇水煎液可以減輕LPS導致的雞腹瀉癥狀。進一步研究發(fā)現(xiàn)白薇水煎液可有效減少LPS對腸絨毛的損傷作用，減少炎性細胞的浸潤，保護腸絨毛的固有形態(tài)。SAA、OVT、AGP、IL-1β這四種炎性因子在LPS刺激后均會高于對照組。但各炎癥因子差異不一，導致這一現(xiàn)象的原因可能為各炎癥因子表達量峰值不同，其中SAA在感染后12 h達到峰值，OVT在24 h達到峰值，而AGP在12 h達到峰值，并且宿主在LPS注射72 h后恢復穩(wěn)態(tài)[24]。從試驗結果可以看出，白薇水煎液(6 g/kg)組能降低SAA、OVT、AGP、IL-1β 4種炎癥因子表達，并可保護LPS所導致的腸黏膜損傷，其原因可能為白薇具有清熱解毒、退熱抗炎的作用。