呂莫然，袁 楓，李子璇，全 榮，朱珊珊，劉 爵*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)林科學(xué)院，北京100097)

豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，ppv)是一種無囊膜的單股線狀DNA病毒，4～6.3 kb。在分類上屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬[1]。細(xì)小病毒是能引起母豬特別是懷孕母豬感染繁殖障礙性疫病的病毒之一。母豬感染后會(huì)不孕、流產(chǎn)，生產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎，臨床上還會(huì)和豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征混合感染，給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

豬細(xì)小病毒是一種自主復(fù)制性病毒，完整病毒粒子由核衣殼蛋白和核酸組成，核心含單股線狀負(fù)鏈DNA，目前PPV分為7種型，豬細(xì)小病毒1型(PPV1)自20世紀(jì)60年代在德國被當(dāng)做細(xì)胞污染物發(fā)現(xiàn)以來[3]，陸續(xù)有幾種新的豬細(xì)小病毒被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鑒定分為PPV1、PPV2、PPV3、PPV4、PPV5、PPV6、PPV7 7種型[4]。2017年，張桂紅等首次對中國廣東兩個(gè)商業(yè)豬場的血清進(jìn)行檢測，樣品中的PPV7基因占32.8%(21/64)，并且與美國毒株有98.7%～99.7%的核苷酸同源性[6]，這是中國關(guān)于PPV7的首次報(bào)道[5]。PPV7的基因組長度為4 103 bp，基因組只有兩個(gè)開放閱讀框(ORF)，其中2 577 bp的5'端編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)，1 529 bp的3'端編碼結(jié)構(gòu)蛋白(cap)[7]。與一些未分類的細(xì)小病毒類似，PPV7在基因序列上缺乏PLA2基序。cap蛋白(衣殼蛋白)是豬細(xì)小病毒的主要免疫原性蛋白，在病毒復(fù)制和感染細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重大作用。目前已經(jīng)發(fā)表80條豬細(xì)小病毒7型序列，其中包括37條完整cap蛋白序列。

人們一直通過接種PPV疫苗來控制病毒傳播，取得了一定成效[8]。但近年來，豬細(xì)小病毒的感染率和發(fā)病率又呈現(xiàn)上升趨勢，如新型豬細(xì)小病毒7型的發(fā)現(xiàn)。目前豬細(xì)小病毒7型相關(guān)的研究較少[9]，因此，研究新型豬細(xì)小病毒有助于后續(xù)新型疫苗的研制以及疾病的控制。本實(shí)驗(yàn)通過序列比對得到豬細(xì)小病毒7型cap蛋白保守序列，添加了BamHI/XhoI酶切位點(diǎn)，根據(jù)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化基因序列，以此合成cap基因，構(gòu)建了pET-32a-cap原核表達(dá)載體，制備豚鼠和小鼠多克隆抗體，為后續(xù)研發(fā)最新型PPV疫苗，控制其傳染性，以及建立ELISA檢測方法鑒定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 載體、工程菌和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pET-32a(+)由北京農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所高新技術(shù)研究室保存；大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；6～8周齡的BALB/c小鼠和約300 g豚鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI，異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)、6×SDS蛋白上樣緩沖液和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；小鼠抗6×His單克隆抗體購自Invitrogen公司；佐劑ISA 71為賽比克公司饋贈(zèng)。

1.2 Cap基因的原核表達(dá)及蛋白純化鑒定

1.2.1 Cap基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)操作說明將BL21(DE3)表達(dá)載體置于冰上融化，取pET-32a-cap質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞中，置于冰上30 min，將離心管置于45 ℃水浴90 s，快速冰浴3 min，再加入500 μL的LB培養(yǎng)基37 ℃，200 r /min振蕩培養(yǎng)1 h。將適量轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布含Amp的LB培養(yǎng)板，37 ℃倒置過夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，上游引物(pET32a-seqF)：GGCCCCAAGGGGTTATGCTAGT，下游引物(PET32a-seqR)：CTGGTTCTGGCCATATGC AC。陽性質(zhì)粒為陽性對照，20 μL體系，其中模板為1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Mix酶10 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；共38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 Cap基因的原核表達(dá)及條件優(yōu)化 將陽性菌落37 ℃過夜培養(yǎng)，次日以1∶100接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.7，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h；8 000 r/min 離心菌液收集菌體，PBS洗滌3次后，超聲波冰浴裂解菌體細(xì)胞。然后離心收集上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定目的蛋白是否表達(dá)以及蛋白可溶性分析。將含有重組質(zhì)粒 pET-32a-cap 的BL21(DE3)菌液按1∶100的比例接種于AMP抗性的LB培養(yǎng)液之中，37 ℃搖菌至OD600值0.6～0.8。分別在相同時(shí)間不同終濃度的IPTG(終濃度為0.4、0.6 、0.8、1、1.2 mmol/L)，相同濃度不同的誘導(dǎo)時(shí)間(2、4、8、6、10、12 h )和相同濃度，相同時(shí)間但不同溫度(17、27、37 ℃)下對重組菌 BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，選擇最佳表達(dá)條件。同時(shí)設(shè)空載體pET-32a(+)轉(zhuǎn)化菌和未誘導(dǎo)的重組BL21(DE3)菌作為對照組。

1.2.3 Cap重組蛋白的純化及鑒定 利用PBS(pH=7.4)重懸菌體沉淀，加入終濃度為1 mg/mL的溶菌酶，冰上放置30 min，超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心30 min收集沉淀，對以不可溶形式表達(dá)的重組蛋白按Ni-NTA Purification System使用說明進(jìn)行純化。蛋白純化后經(jīng)Western Blotting檢測純化效果，Bradford法測定蛋白濃度，將純化cap重組蛋白時(shí)的洗滌液和洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，37 ℃封閉2 h；以抗His標(biāo)簽單克隆抗體(1∶2 000 稀釋)為一抗，37 ℃孵育1 h；以HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶3 000稀釋)為二抗，37 ℃孵育50 min，在DAB溶液中顯色。

1.3 豚鼠和小鼠抗cap蛋白多克隆抗體的制備

1.3.1 動(dòng)物免疫 用滅菌PBS稀釋 cap重組蛋白，與ISA71佐劑按照3∶7(體積比)比例混合，充分乳化，采用皮下多點(diǎn)注射，豚鼠1.6 mL/只，即含 cap重組蛋白為80 μg/只。小鼠1 mL/只，即含cap重組蛋白為10 μg/只。首次免疫后每隔15 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫3次，后2次免疫方法同第一次免疫。第3次免疫7 d后經(jīng)心臟采血，分離血清備用。免疫前采集豚鼠和小鼠1 mL血液分離血清，作為陰性血清對照。

1.3.2 多克隆抗體效價(jià)的測定 利用間接ELISA方法測定多克隆抗體效價(jià)，收集第二次免疫和第三次免疫后采集的豚鼠血清和小鼠血清。將純化的重組 pET-32a-cap蛋白200 ng/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃過夜；洗滌后，向每孔加入脫脂奶，37 ℃封閉1 h；洗滌后，加入(1∶100)～(1∶500 000)倍比稀釋的多克隆陽性血清，免疫前豚鼠和小鼠血清作為陰性對照，37 ℃孵育1 h；洗滌后，向各孔加入100 μL 1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗豚鼠IgG和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h；洗滌后，加入100 μLTMB底物溶液，室溫反應(yīng)10 min，H2SO4終止反應(yīng)；使用酶標(biāo)儀測定OD450nm值。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

如圖1所示，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞在平板的陽性菌鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物及質(zhì)粒與試驗(yàn)預(yù)期大小一致。如圖2所示，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-cap經(jīng)BamⅠ/HindⅢ雙酶切后，分別在5 900 bp和1 422 bp處有1條特異性條帶，與預(yù)期大小一致。

A.重組質(zhì)粒pET-32a-cap PCR擴(kuò)增結(jié)果 M1.DL5 000 DNA Marker；1A.重組質(zhì)粒pET-32a-cap PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.陽性菌液擴(kuò)增結(jié)果 B重組質(zhì)粒pET-32a-cap PCR酶切鑒定結(jié)果 M1.DL2 000 DNA Marker；1B.重組質(zhì)粒pET-32a-cap PCR雙酶切擴(kuò)增結(jié)果；M2.DL5 000 DNA Marker

2.2 原核表達(dá)可溶性分析和表達(dá)條件優(yōu)化

將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，與預(yù)期大小一致，對照組樣品則沒有特異條帶。

通過對比誘導(dǎo)條件，由圖3可知，隨著誘導(dǎo)劑(IPTG)終濃度的增加，重組cap蛋白的表達(dá)量沒有出現(xiàn)顯著的變化，因IPTG有一定毒性，故選擇最低濃度0.4 mmol/L；圖4表明，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為10 h 時(shí)，蛋白表達(dá)量最佳；圖5表明，溫度在37 ℃時(shí)，重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)表達(dá)量最大。綜上所述，重組cap蛋白的最佳表達(dá)條件：誘導(dǎo)劑(IPTG)的終濃度為0.4 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為10 h。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)的pET-32a-cap蛋白表達(dá)上清；2.誘導(dǎo)的pET-32a-cap蛋白表達(dá)沉淀

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.4 mmol/L；2.IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.6 mmol/L；3.IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.8 mmol/L；4.IPTG誘導(dǎo)終濃度為1 mmol/L；5.IPTG誘導(dǎo)終濃度為1.2 mmol/L；6.pET-32a 空載體；7.未誘導(dǎo)的pET-32a-cap蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的pET-32a-cap蛋白；2.pET-32a空載體；3.誘導(dǎo)12 h的pET-32a-cap蛋白；4.誘導(dǎo)10 h的pET-32a-cap蛋白；5.誘導(dǎo)8 h的pET-32a-cap蛋白；6.誘導(dǎo)6 h的pET-32a-cap蛋白；7.誘導(dǎo)4 h的pET-32a-cap蛋白；8. 誘導(dǎo)2 h的pET-32a-cap蛋白

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)溫度為17 ℃；2.誘導(dǎo)溫度為27 ℃；3.誘導(dǎo)溫度為37 ℃；4. pET-32a 空載體；5.未誘導(dǎo)的pET-32a-cap蛋白

2.3 蛋白純化結(jié)果

在變性條件下，利用Ni-NTA瓊脂糖樹脂對菌體裂解產(chǎn)物沉淀中的重組pET-32a-cap蛋白進(jìn)行了純化。純化過程按Ni-NTA Purification System使用說明進(jìn)行。SDS-PAGE結(jié)果表明，通過純化獲得了純度約為90%的重組pET-32a-cap蛋白，終濃度為0.3 mg/mL。圖6表明重組蛋白經(jīng)純化后純度較高，片段大小均與預(yù)期結(jié)果相一致。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 純化前的pET-32a-cap蛋白；2. 流穿液；3～6. 洗滌液；7～9. 洗脫液

2.4 多克隆血清抗體效價(jià)的測定結(jié)果

收集第二次免疫和第三次免疫后7 d采集的豚鼠血清和小鼠血清。將純化的重組 pET-32a-cap蛋白200 ng/孔包被酶標(biāo)板利用間接ELISA方法對豚鼠和小鼠的多克隆抗體進(jìn)行效價(jià)測定，將多克隆陽性血清(1∶100)～(1∶500 000)倍比稀釋，當(dāng)多克隆抗體孔的OD450 nm與陰性對照孔的OD450 nm值的比值(P/N)>2.1時(shí)，多克隆抗體的最高稀釋度為多克隆抗體的效價(jià)。制備的多克隆血清的抗體效價(jià)約可達(dá)1∶50 000。

3 討 論

1983年豬細(xì)小病毒在我國首次分離后，逐漸呈全國性分布，陽性感染率在60%以上[10]。我國一直通過PPV疫苗來控制病毒傳播，并取得一定效果，豬群發(fā)病率有所下降[11]。但近年來，由于豬細(xì)小病毒的進(jìn)化出現(xiàn)了6型、7型等新型豬細(xì)小病毒，細(xì)小病毒的感染率和發(fā)病率又逐漸上升，使得PPV的防控形勢變得嚴(yán)峻[12]。

PPV 7只有兩個(gè)開放閱讀框，其中3'端開放閱讀框編碼結(jié)構(gòu)蛋白，即cap蛋白，它是病毒粒子的主要成分，具有良好的抗原性和免疫原性，是構(gòu)建重組基因工程疫苗的首選靶標(biāo)。本試驗(yàn)旨在體外表達(dá)cap蛋白，為研究豬細(xì)小病毒7型的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。原核表達(dá)系統(tǒng)以培養(yǎng)方便、價(jià)格低廉、易于批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)成為外源蛋白表達(dá)的首選表達(dá)系統(tǒng)。在表達(dá)載體方面，本試驗(yàn)選取原核表達(dá)載體pET-32a，此載體具有T7強(qiáng)啟動(dòng)子和His標(biāo)簽，便于目的蛋白的純化；在重組融合蛋白的鑒定方面，本試驗(yàn)應(yīng)用抗His標(biāo)簽的單克隆抗體檢測到重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確的融合表達(dá)。

目前病毒的檢測方法除了常用的血凝與血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)和核酸探針等檢測技術(shù)[13]，ELISA 以其操作簡單、耗時(shí)短、成本低且靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢成為當(dāng)今監(jiān)測和檢測病毒的首選手段[14]。在豬細(xì)小病毒7型檢測方面，由于無商品化的抗體，導(dǎo)致了ELISA檢測試劑盒領(lǐng)域的空白。因此本試驗(yàn)利用表達(dá)的豬細(xì)小病毒7型cap蛋白免疫小鼠和豚鼠，制備了多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA方法檢測其抗體效價(jià)達(dá)到 1∶50 000，為建立檢測新型豬細(xì)小病毒ELISA檢測方法提供了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)表達(dá)純化的重組cap蛋白以及制備的豚鼠和小鼠抗cap多克隆抗體為研究豬細(xì)小病毒7型的研究和控制提供了基礎(chǔ)，具有潛在意義。