韓 磊，周常喜，趙一帆，張艷萍，崔利鑫，吳實(shí)權(quán)，陳 武

(北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

牙周疾病是成年犬最常見(jiàn)口腔疾病之一，在所有犬種中患病率高達(dá)80%以上[1]。在英國(guó)，犬的牙周疾病已經(jīng)與骨關(guān)節(jié)炎和超重/肥胖并列成為影響動(dòng)物福利的三大重要疾病[2]。

細(xì)菌及其形成的牙菌斑是一切口腔疾病的始動(dòng)因子[3]。由于衛(wèi)生習(xí)慣或口腔清潔的難度大，在犬常會(huì)形成牙菌斑的大量蓄積，口腔微生物濃度增高，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的口臭、齒齦炎、齒齦出血、齲齒、齒折與齒根膿腫等繼發(fā)疾病。輕則影響食欲和采食量，重則進(jìn)食困難甚至停止進(jìn)食，繼發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良和多種疾病乃至危及生命。分析牙菌斑的微生物菌群結(jié)構(gòu)，對(duì)于防治各種口腔疾病，保障犬只健康有著十分重要的意義。近年來(lái)，人們對(duì)微生物組研究領(lǐng)域的革命性進(jìn)展都是歸功于高通量測(cè)序技術(shù)以及宏基因組學(xué)的發(fā)展。同在高通量測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)之前的細(xì)菌培養(yǎng)的方法相比，許多培養(yǎng)條件苛刻的微生物在高通量測(cè)序技術(shù)的幫助下得以被檢測(cè)到，而且高通量測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到許多的低豐度物種，因此使用不依賴培養(yǎng)法的細(xì)菌16S rRNA基因測(cè)序?yàn)榭焖俅_定犬牙菌斑樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)和犬牙科疾病的診斷與防治藥物的研發(fā)提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣本來(lái)自于北京地區(qū)動(dòng)物醫(yī)院接受免疫接種的健康犬64只，品種不限，年齡分布在2到8歲之間。試驗(yàn)犬在采樣前4周內(nèi)沒(méi)有接受過(guò)抗生素治療，并且在牙齒上可以用眼觀察到存在顏色深淺不同的牙菌斑。

采樣前，先用無(wú)菌生理鹽水對(duì)要進(jìn)行樣本采集的牙齒進(jìn)行沖洗，將唾液以及食物殘?jiān)宄?，然后使用無(wú)菌刀片在沖洗區(qū)域沿牙齒表面刮擦，使用3只無(wú)菌棉棒分別沾取刀片上的牙菌斑樣本，將無(wú)菌棉棒連同牙菌斑樣本一同分別置15 mL無(wú)菌離心管中，-80℃冰箱保存。隨機(jī)抽取一只樣本進(jìn)行檢測(cè)，其余2只作為備份。

1.2 方 法

1.2.1 樣本總DNA提取，PCR擴(kuò)增及測(cè)序 牙菌斑樣本的DNA采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50)試劑盒嚴(yán)格按照使用說(shuō)明提取，然后使用1%的瓊脂糖凝膠電泳來(lái)對(duì)提取出來(lái)的DNA進(jìn)行完整性、純度、片段大小和濃度的檢測(cè)。

16S rRNA的V3～V4可變區(qū)通用引物設(shè)計(jì)為：341F：CCTACGGGNBGCASCAG，805R：GACTACNVGGGTATCTAATCC。PCR體系擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸60 s，共25個(gè)循環(huán)。

樣品送至博淼生物科技有限公司在HiSeq2500/MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)牙菌斑微生物的16SrRNA V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 首先，用FASTQC軟件對(duì)原始的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，將Adaptor和低質(zhì)量的堿基序列去除掉，對(duì)測(cè)序原始的下機(jī)數(shù)據(jù)和質(zhì)控后的樣品reads數(shù)及數(shù)據(jù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后對(duì)得到的全部有效序列進(jìn)行后續(xù)分析。依據(jù)GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Mothur軟件進(jìn)行計(jì)算，最終得到可用的不包含嵌合體的序列。

根據(jù)序列的相似性水平，在QIIME(V1.9.1)軟件中以97%的序列相似性將序列分化為數(shù)個(gè)操作分類單元(Operation Taxonomic Unit，OTU)，在得到OTU分組情況后，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的reference taxonomy(RT)參考，將OTU進(jìn)行分類注釋。

將各樣本的OTU在QIIME2軟件上進(jìn)行計(jì)算，從而得出稀釋曲線和多樣性指數(shù)，檢驗(yàn)此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性以及可用性。然后對(duì)各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析，以在所有樣本中均有分布并且相對(duì)豐度均值≥2% 的菌屬[4]為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)中的核心菌屬進(jìn)行定義。

2 結(jié) 果

2.1 牙菌斑樣本的DNA序列分析

牙菌斑樣本的DNA經(jīng)過(guò)在Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)上的測(cè)序，本次試驗(yàn)一共獲得1 567 731條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個(gè)樣本為24 495條，這些序列可以被分類為 14個(gè)門(mén)，159個(gè)屬。通過(guò)QIIME2軟件對(duì)測(cè)序的出的OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，繪制出各個(gè)樣本的chao1指數(shù)，Shannon-Wiener指數(shù)，Simpson指數(shù)以及Observed-species稀疏曲線圖，得出的所有曲線趨勢(shì)全部趨于平坦，代表本次測(cè)序的深度和寬度均達(dá)到要求。

2.2 牙菌斑微生物結(jié)構(gòu)

根據(jù)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的RT將本次試驗(yàn)測(cè)得的序列進(jìn)行物種分類，再構(gòu)建樣本與物種分類單元序列豐度矩陣，使用QIME軟件對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類進(jìn)行序列豐度計(jì)算，從64例健康犬牙菌斑樣本中分類到 14個(gè)門(mén)。其中門(mén)水平的高豐度菌落(相對(duì)豐度>5%)有5個(gè)，占總序列數(shù)的96.93 %，分別為：變形菌門(mén)(Proteobacteria，37.24%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，28. 48%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria，12. 26%)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes ，9.58%)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria，9. 38%)。本次試驗(yàn)除了發(fā)現(xiàn)5個(gè)豐度較高門(mén)水平的菌落以外，還有 5個(gè)門(mén)水平的菌落在每個(gè)樣本中均有分布但相對(duì)豐度較小，分別是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、綠菌門(mén)(Chlorobi)、TM7、SR1、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)。由此可見(jiàn)，牙菌斑微生物群落在門(mén)水平的分布相對(duì)集中。

同時(shí)，犬牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平的分布也相對(duì)集中，根據(jù)對(duì)核心菌屬的定義共得到6個(gè)核心菌屬，占微生物總序列的 73.41% 。分別為：卟啉單胞菌屬(Porphyromonas，19.96%)、放線菌屬(Actinomyces，14.12%)、棒桿菌屬(Corynebacterium，12.19%)、奈瑟菌屬(Neisseria，13.24%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，9.17% )、密螺旋體屬 (Treponema，4.73%)，見(jiàn)圖 1。

注：圖中橫坐標(biāo)代表每個(gè)樣本，縱坐標(biāo)為百分比，每個(gè)曲線色塊代表一個(gè)菌屬所占該樣本的微生物群落屬層面的相對(duì)含量，不同顏色的色塊代表不同的菌屬

3 討 論

在本研究之前，牙菌斑 (plaque)這一名詞最早被Williams于1989年所提出，并且國(guó)外寵物臨床上的許多研究已經(jīng)揭示犬牙周病的主要病因?yàn)檠谰叩募?xì)菌微生物所導(dǎo)致的[5]。目前，寵物犬的飲食習(xí)慣為質(zhì)地相對(duì)較軟的商品糧和罐頭等食物，這會(huì)導(dǎo)致食物殘?jiān)例X之間的摩擦作用顯著下降 ,使得黏性食物殘?jiān)械牡鞍自谘例X上大量附著，充足的蛋白為口腔中的常在細(xì)菌提供了營(yíng)養(yǎng)以及附著點(diǎn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的聚合從而形成了牙菌斑。而且對(duì)寵物犬牙齒進(jìn)行刷牙的護(hù)理經(jīng)常被大多數(shù)的動(dòng)物主人所忽視，造成牙菌斑在牙齒上的大量增厚蓄積，引發(fā)犬的各類牙周疾病。所以說(shuō)，牙菌斑是一切口腔疾病的始動(dòng)因子[6]。因此，對(duì)于牙菌斑的微生物群落結(jié)構(gòu)的研究很有必要。

微生物組中的核心菌屬是指所有或者絕大多數(shù)樣本共有的微生物[7]，目前在國(guó)內(nèi)的寵物臨床中，類似對(duì)犬牙菌斑微生物群落的相關(guān)研究報(bào)道較少，部分現(xiàn)有的研究只對(duì)牙菌斑微生物群落中所含有的細(xì)菌菌屬進(jìn)行了報(bào)道[8]，而本研究通過(guò)對(duì)1 567 731條優(yōu)質(zhì)的可鑒定序列進(jìn)行分析，確定了核心菌屬群落在犬牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)中的分布。通過(guò)本次試驗(yàn)可以得出，同在門(mén)水平定義微生物的核心微生物組相比，在屬水平來(lái)定義要顯得更加合理。

在國(guó)外對(duì)牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，Amy Sturgeon[9]等通過(guò)對(duì)六只狗的健康口腔樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在健康口腔中最常見(jiàn)的菌屬是卟啉單胞菌屬(39.2%)，鐮刀菌屬(4.5%)，嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌屬(3.8%)，德克斯氏菌屬(3.7%)，莫拉氏菌屬(3.3%)和貝氏菌屬(2.7%)。通本次試驗(yàn)的結(jié)果相對(duì)比，牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)中與健康口腔中微生物核心菌屬差異較大，只有卟啉單孢菌屬的相對(duì)豐度降低，這可能與卟啉單胞菌屬與后期增長(zhǎng)的密螺旋體屬相結(jié)合，而形成了口腔微生物的“紅色復(fù)合物”有關(guān)[10]。 Ian J. Davis[11]等從健康牙齦，牙齦炎和輕度牙周炎的223只狗中收集齦下菌斑樣品發(fā)現(xiàn)，卟啉單胞菌是所有疾病階段中最豐富的屬，尤其是在健康牙齦樣本中更為明顯。

Changin等通過(guò)對(duì)人與犬的牙菌斑的主要菌屬對(duì)比，發(fā)現(xiàn)犬類的主要屬是放線菌屬，卟啉單胞菌屬和奈瑟氏球菌屬[12]，Dent和Marsh對(duì)9種動(dòng)物(猴子，狐猴，老虎， ，長(zhǎng)頸鹿和4只美國(guó)可卡犬)的牙菌斑進(jìn)行了研究，證明了所有動(dòng)物共有一個(gè)基本菌斑微生物群落的假設(shè)，他們提出以放線菌屬，棒桿菌屬，梭菌屬，奈瑟菌屬為代表可能構(gòu)成人和動(dòng)物齒齦緣斑塊的基本成分[13]。Takada和Hirasawa通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)牙菌斑與犬牙周炎疾病關(guān)系密切，他們認(rèn)為棒桿菌屬在犬牙周炎中的作用可能與牙齦卟啉單胞菌在人牙周炎中的作用相同[14]。Patel和Vadalia通過(guò)對(duì)53只犬牙菌斑相關(guān)的口腔細(xì)菌菌群進(jìn)行鑒定，他們從犬的口腔中分離出的菌屬包括放線菌屬，奈瑟菌，卟啉單胞菌屬，密螺旋體屬可能構(gòu)成犬牙菌斑的基本成分[11]。Davis等在犬牙菌斑的大型橫斷面研究中，發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌是所有健康狀態(tài)中最常見(jiàn)的細(xì)菌，在牙齦下菌斑中的相對(duì)豐度為7.4[15]%。在本研究中，對(duì)犬牙菌斑樣本中核心菌屬的研究同以上文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，表明不同地區(qū)犬的口腔牙菌分布基本相同。

犬牙齒所在的口腔環(huán)境復(fù)雜，隨著溫度，pH值以及飲食習(xí)慣的變化都會(huì)導(dǎo)致牙齒表面的微生物群落發(fā)生改變，雖然本研究對(duì)牙菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)中的核心菌屬群落做出了探究，但是，如何針對(duì)菌屬結(jié)構(gòu)，采取有效減少口腔細(xì)菌數(shù)量的方法，從而保護(hù)牙齒健康，這些都有待今后去進(jìn)一步探究。

綜上所述，通過(guò)本次對(duì)64例健康犬牙菌斑微生物群落的高通量測(cè)序分析確定了6個(gè)核心菌屬，為進(jìn)一步研究犬牙菌斑和預(yù)防犬牙周疾病的藥物研發(fā)及篩選提供了基礎(chǔ)研究材料，并且為寵物臨床上對(duì)于犬牙周疾病的治療提供了參考。