張 潔，程 昊，田 佶，張 杰，姚允聰

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

觀賞海棠[1]是蘋果屬植物中具有較好觀賞價(jià)值的植物之一。在中國分布廣泛，其花、果、葉均具有極高的觀賞價(jià)值。根據(jù)海棠花瓣的顏色，可將其分為紅花、粉化和白花3種[2]。具有代表性的分別是‘王族’、‘印第安魔力’和‘當(dāng)娜’。

花青素對植物顏色產(chǎn)生重要的影響[3]?；ㄇ嗨氐慕M分及其比例是影響花朵顏色的重要原因[4]。在植物體內(nèi)，花青素通過與各種單糖結(jié)合形成糖苷，因此稱為花色苷(Anthocyanin)[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，影響植物花色苷合成的基因分兩類，一類是保守的結(jié)構(gòu)基因，直接編碼參與花色苷生物合成的酶[6]。另一類是調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)過程和含量以及花色苷的積累[7]。

MicroRNA (miRNA) 是一類內(nèi)源的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小RNA，長度在19～25個(gè)核苷酸(nt)[8]。miRNA在植物中的調(diào)節(jié)作用有研究表明，在擬南芥中，miR828通過靶向調(diào)節(jié)花色苷合成的轉(zhuǎn)錄因子PAP1，PAP2和MYB113，從而負(fù)調(diào)控花色苷的積累[9]。高表達(dá)miR828通過抑制轉(zhuǎn)錄因子MYB75, MYB82, MYB90和MYB113從而減少花色苷的積累[10]。缺磷會(huì)導(dǎo)致植物中花色苷的積累，miR399d在缺磷條件下通過其靶基因和下游相關(guān)基因?qū)ㄉ者M(jìn)行了調(diào)節(jié)[11]。miR156是眾多研究者研究的熱點(diǎn)，miR156通過靶向負(fù)調(diào)節(jié)花色苷的SPL轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控花色苷的積累[12]。在蘋果果皮的光照著色研究中，MLNC3.2和MLNC4.6對miR156a具有內(nèi)源性靶點(diǎn)模擬的作用，在光誘導(dǎo)花青素生物合成過程中可以阻止miR156a對SPL2-like和SPL33的裂解[13]。

花色苷是影響花瓣顏色重要的物質(zhì)之一。本研究擬以不同品種海棠為試材，對其花瓣進(jìn)行miR156a前體基因克隆進(jìn)行序列比較，并通過分光光度法測量花瓣的花色苷含量以及qRT-PCR方法測定miR156a的相對表達(dá)量，以揭示miR156a對觀賞海棠花瓣花色苷形成的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料是2019年春天采集的北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)蔣各莊村有機(jī)觀光蘋果園中自然生長的‘王族’、‘印第安魔力’和‘當(dāng)娜’3個(gè)品種的海棠花瓣，分4個(gè)時(shí)期取樣，分別命為小蕾、大蕾、初花和盛開。采后先在冰盒里存樣，迅速用液氮凍存，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取植物RNA及反轉(zhuǎn)錄 miRNA采用艾德萊EASYspin多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒，提取海棠花瓣的RNA。采用全式金miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)miRNA。兩步法反轉(zhuǎn)基因克隆使用的cDNA。

1.2.2 pre-miR156a基因克隆 由于蘋果和海棠同屬于蘋果屬植物，使用GDR找到金冠的pre-miR156a的基因序列，查到該序列在15號(hào)染色體上。在前體序列的上游和下游各取200 bp左右的序列，構(gòu)成一段400～500 bp的基因序列。通過Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。正向引物McmiR156a-F：5’-ATCCTGGTAGATAAGGGCAT-3’；反向引物McmiR156a-R：5’-GTTGGGAGAAAAACACCTGG-3’。以花瓣cDNA為模板，反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL、McmiR156a-F 1.5 μL、McmiR156a-R 1.5 μL、擎科生物金牌Mix 45 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火溫度10 s，72 ℃延伸時(shí)間5 s，30 cycles，72 ℃總延伸2 min，4 ℃保存。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目對應(yīng)位置的基因片段條帶，膠回收試劑盒使用艾德萊瓊脂糖凝膠純化試劑盒。膠回收產(chǎn)物連接全式金pEASY-Blunt載體，轉(zhuǎn)Trans-T1大腸感受態(tài)，涂板，挑菌，菌液PCR，將PCR產(chǎn)物條帶正確的菌液送測序。

1.2.3 qRT-PCR qRT-PCR選擇大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)酶進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)體系參照說明書。采用qRT-PCR兩步法( 95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，39次循環(huán))為反應(yīng)條件，以U6作為內(nèi)參基因，miR156a的熒光引物為miR156a成熟體序列，檢測miR156a的相對表達(dá)量。待測樣品的數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 分光光度法測花色素苷含量 將花瓣在液氮中研磨成細(xì)粉，稱取0.1 g樣品，用植物花色苷提取試劑盒提取花色苷。用分光光度計(jì)分別測量提取液在530 nm處和700 nm處的吸光度值，運(yùn)用公式計(jì)算得到花色苷含量。

1.2.5McmiR156a的靶基因預(yù)測 通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/)對McmiR156a的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，通過NCBI比對，找到該基因的詳細(xì)描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種海棠花瓣花色比較 通過照片可以看出，隨著生長時(shí)期的增加，花瓣顏色逐漸變淺(圖1)，王族花瓣顏色逐漸變淺，在盛開時(shí)期，花朵依然紅艷。印第安魔力花瓣顏色由紅逐漸變粉，而當(dāng)娜花瓣最初是粉紅色，當(dāng)生長到初花時(shí)期幾乎為白色，盛開時(shí)全白。3種花瓣花色苷含量也呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢(圖2)，同一時(shí)期3個(gè)品種的花瓣花色苷含量也出現(xiàn)了顯著差異，王族花色苷含量最多，當(dāng)娜花瓣花色苷含量最少。

圖1 3種海棠花瓣表型圖

注：每組數(shù)據(jù)顯示為平均值 SE (n=3)。不同的小寫字母表示同一品種不同時(shí)期數(shù)據(jù)差異在P <0.05，不同的大寫字母表示同一時(shí)期不同品種數(shù)據(jù)差異在P <0.05

2.2 3種海棠花瓣miR156a基因比較

以3種海棠花瓣cDNA為模板，進(jìn)行miR156a基因克隆，得到長度為489 bp的加保護(hù)堿基的前體序列(圖3)。miR156具有保守性，通過將3個(gè)品種的序列測序后與金冠miR156a前體序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種海棠花瓣中miR156a前體90 bp序列沒有差異(圖4)。

圖3 miR156a前體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 miR156a前體序列比對

2.3 McmiR156a靶基因預(yù)測結(jié)果

通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站psRNATarget對miR156a靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選得到以下與其高度互補(bǔ)并且假陽性低的靶基因(表1)。分析發(fā)現(xiàn)miR156a靶基因多為SPL家族，通過NCBI網(wǎng)站查詢得到靶基因序列，并對其做互補(bǔ)性分析。發(fā)現(xiàn)SPL6(Squamosa promoter binding like 6)基因只有一個(gè)堿基不匹配，不匹配堿基為U-G，剩余靶基因歲雖也是一個(gè)堿基不匹配，但不匹配堿基為U-U，相對的期望值要大。

2.4 3種海棠花瓣中miR156a相對表達(dá)量比較

以3種海棠花瓣為模板，提取miRNA，通過熒光定量PCR的方法，計(jì)算miR156a的相對表達(dá)量。

表1 miR156a靶基因預(yù)測結(jié)果

通過分析可以看出，隨著花瓣顏色變淺，miR156a的相對表達(dá)量逐漸升高，并且3種不同顏色的花瓣中，王族的miR156a相對表達(dá)量較低，其余兩種較高，在顏色變化明顯的印第安魔力花瓣中4個(gè)時(shí)期miR156a的相對表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異(圖5)。說明miR156a在花色苷生物合成中起到了負(fù)調(diào)控的作用。

注：每組數(shù)據(jù)顯示為平均值 SE (n=3)。不同的小寫字母表示同一品種不同時(shí)期數(shù)據(jù)差異在P <0.05，不同的大寫字母表示同一時(shí)期不同品種數(shù)據(jù)差異在P <0.05

3 討 論

觀賞海棠是中國極具綜合觀賞價(jià)值的植物。其花果葉均具有觀賞價(jià)值。影響植物顏色的重要物質(zhì)之一是花色苷，花色苷不僅能夠讓植物色彩艷麗，便于授粉和傳播種子，又能抵御害蟲侵襲[14]，減少植物受到紫外線傷害。同時(shí)對人體有許多有益功效，比如抑制脂質(zhì)過氧化、保護(hù)視力、預(yù)防糖尿病、保護(hù)肝臟和清除體內(nèi)自由基等[15]?；ㄉ諛O其不穩(wěn)定并且在不同生長時(shí)期，花色苷含量也不相同[16]。在本研究中，隨著植物的生長，花瓣中花色苷的含量逐漸降低。因此如何提高花色苷的生物合成量，降低花色苷的降解，需要更深入的研究。

研究者常使用基因調(diào)控的方法可以使花色苷生物合成增多。蘋果中MdHY5受光照和脫落酸誘導(dǎo)，在蘋果愈傷組織中高表達(dá)HY5，可以調(diào)節(jié)MYB10基因和下游花青素生物合成基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花青素的積累[17]。miRNAs是一類負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA，有研究表明，葡萄中，miR828和miR858抑制靶基因MYB114從而促進(jìn)花青素的生物合成[18]。獼猴桃果實(shí)測序中發(fā)現(xiàn)miR858高度表達(dá)可抑制MYBC1基因的表達(dá)，而MYBC1可與LDOX基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制獼猴桃果實(shí)花青素的生物合成[19]。植物發(fā)育中miR156-SPL模塊廣為研究，在柑橘的愈傷組織中，miR156-SPL被增強(qiáng)可以增加愈傷組織對硒的調(diào)控能力，從而促進(jìn)愈傷組織的生物學(xué)進(jìn)程[20]。miR156/miR157通過控制SPL基因的變化來調(diào)節(jié)擬南芥營養(yǎng)期的轉(zhuǎn)變[21]。擬南芥中miR156e-3p的高表達(dá)抑制SPL1的轉(zhuǎn)錄水平，從而促進(jìn)DFR的高表達(dá)使得擬南芥中花色苷積累[22]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，不同顏色海棠花瓣中miR156a的相對表達(dá)量不同，顏色深的miR156a表達(dá)量低，顏色淺的表達(dá)量高。本研究結(jié)果對miR156a及靶基因SPL對花色素苷的具體調(diào)控作用提供一定的理論基礎(chǔ)。