魏婧薇，趙文超，王紹輝

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實驗室，北京 102206)

番茄因其果實風(fēng)味獨(dú)特、富含維生素和礦質(zhì)元素等營養(yǎng)元素而被廣受歡迎與喜愛，并且種植生產(chǎn)番茄是農(nóng)民增收致富的重要途經(jīng)[1,2]。然而，根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)卻是侵染植物的主要病原之一，其分布范圍廣泛[3]，其中番茄根結(jié)線蟲病是影響番茄根部生長發(fā)育的最主要病害。當(dāng)根結(jié)線蟲入侵番茄根系后，在根部組織建立取食位點(diǎn)，形成肥腫畸形瘤狀的根結(jié)，造成根系的輸導(dǎo)組織被破壞，影響了水分和養(yǎng)分的正常運(yùn)輸，從而導(dǎo)致地上部生長不良，葉片逐漸黃化萎縮，果實脫落，產(chǎn)量下降[4]。

茉莉酸鹽(Jasmonates，JAs)是除生長素、赤霉素(GA)、乙烯(ET)、細(xì)胞分裂素和脫落酸以外的一種新的植物激素[5]。茉莉酸對植物的生存發(fā)育具有及其重要的作用，它既可以調(diào)節(jié)植物根的生長、雄蕊發(fā)育、葉片衰老、表皮毛形成等生長發(fā)育過程，又可以幫助植物防御病原侵染、昆蟲噬咬以及抵御干旱等脅迫影響[6]。根據(jù)目前研究報道可知，植物中的MYC類轉(zhuǎn)錄因子屬于bHLH類轉(zhuǎn)錄因子家族，是茉莉酸類激素響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子[7]。當(dāng)茉莉基-異亮氨酸(JA-Ile)是激素的受體活性形式時，SCFCOI1-JAZ復(fù)合物充當(dāng)JA-Ile的共受體，在穩(wěn)定狀態(tài)下，JAZ蛋白與MYC2相互作用并抑制后者的轉(zhuǎn)錄活性；當(dāng)響應(yīng)內(nèi)部或外部刺激，升高的JA-Ile水平會促進(jìn)JAZ阻遏物的SCFCOI1依賴性降解，從而激活JA響應(yīng)基因的MYC2定向轉(zhuǎn)錄，以協(xié)調(diào)JA介導(dǎo)的創(chuàng)傷和病原體反應(yīng)的激活[8][9]。另外，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中MYC2可以差異調(diào)節(jié)JA響應(yīng)基因的兩條分支，正向調(diào)節(jié)植物對傷害的反應(yīng)和負(fù)調(diào)控植物對病原體感染的抗性反應(yīng)[10]。

然而，番茄中有關(guān)茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控番茄對南方根結(jié)線蟲敏感性的研究相對較少，并且本試驗室前人研究表明番茄茉莉酸合成突變體spr2較CM野生型株系和茉莉酸過表達(dá)35S::PS株系更容易感染根結(jié)線蟲，甚至外源噴施茉莉酸甲酯可以提高番茄對根結(jié)線蟲的抵抗力[11]。在本研究中以番茄茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的MYC2為研究對象，首先對該基因做了基礎(chǔ)的生物信息學(xué)分析，然后在接種南方根結(jié)線蟲后對MYC2敲除株系(MYC2-CR)和野生型株系(CM)統(tǒng)計了根結(jié)指數(shù)、根結(jié)分級、線蟲體寬等指標(biāo)，初步探究了MYC2影響番茄對南方根結(jié)線蟲敏感性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要試劑設(shè)備

番茄材料為農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實驗室自繁的番茄野生型CM株系(Solanumlycopersicumcv Castlemart)，以及純合的MYC2CRISPR株系(MYC2-CR)。

試劑有次氯酸鈉、乙醇、甲醛、二甲苯、甲苯胺藍(lán)染液、熔點(diǎn)為54～56 ℃和56～58 ℃的石蠟、MS粉、植物凝膠、蔗糖、NaCl等化學(xué)試驗試劑，以及PrimerSTAR MIX高保真克隆酶，Taq克隆酶、DNA膠回收試劑盒、植物RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等生物試驗試劑。儀器設(shè)備有電磁爐、恒溫培養(yǎng)箱、切片機(jī)、烘片機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、水浴鍋、電子天平、高溫滅菌鍋、正置熒光顯微鏡等。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄MYC2的克隆與基礎(chǔ)信息分析 首先利用MYC2的基因號Solyc08g076930.1從番茄基因庫(https://solgenomics.net/)中BLAST得到其DNA、CDS序列，然后分別設(shè)計引物(F：ATGACTGAATACAGCTTGC，R：TTAGTGTGTTTCAGCAATTTTCGA)并從DNA、cDNA中克隆得到基因全長序列、CDS序列，利用MEGA5軟件(https://www.megasoftware.net/)等進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白序列比對分析、進(jìn)化樹分析。

1.2.2 番茄的種植和管理 將番茄種子浸泡在55 ℃溫水中3～5 h，接著用3%的次氯酸鈉溶液消毒10～15 min，然后沖洗后將種子放至26 ℃培養(yǎng)箱中催芽至種子露白。再將露白的種子播種到裝有草炭和蛭石2∶1混合基質(zhì)的穴盤中，置于26～28 ℃/16～18 ℃、16 h光照/8 h黑暗的培養(yǎng)室中培養(yǎng)出苗。當(dāng)幼苗長到“兩葉一心”時將其移入9 cm的營養(yǎng)缽中，按照同樣的溫光濕條件培養(yǎng)。

1.2.3 南方根結(jié)線蟲的繁育與接種 在4～5片真葉齡番茄的根系周圍接種定量的二齡幼蟲，接種后35～50 d后，挑取收集植株根部的淡黃色卵塊，置于26 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱中孵化，逐天收集孵化出的二齡幼蟲，參考王紹輝等的方法[12]計算線蟲密度，在距離植株根部1.5 cm左右處用1 mL移液器槍頭打4個約2 cm深的小孔，均勻接種至總量為500頭/株，對照組注入等量的清水，接種完成后在基質(zhì)表面噴灑適量的水以保持濕潤。

1.2.4 不同番茄株系根結(jié)指數(shù)及分級的統(tǒng)計 在不同番茄株系接種南方根結(jié)線蟲7、14、21 d后，分別進(jìn)行根結(jié)指數(shù)的統(tǒng)計。稱取每株植株的根系鮮重并統(tǒng)計相應(yīng)的根結(jié)數(shù)量，按照根結(jié)指數(shù)=根結(jié)數(shù)/根系鮮重計算根結(jié)指數(shù)(Gall Index)，每株系6株重復(fù)。在接種南方根結(jié)線蟲第21 d時番茄株系根結(jié)大小代表性強(qiáng)、易于統(tǒng)計，根據(jù)根結(jié)線蟲的根結(jié)分級標(biāo)準(zhǔn)對各株系根結(jié)進(jìn)行分級，每株系6株重復(fù)。線蟲根結(jié)短徑分為7個級別：1級根結(jié)(0～0.5 mm) 2級根結(jié)(0.5～1.0 mm)、3級根結(jié)(1.0～1.5 mm)、4級根結(jié)(1.5～2.0 mm)、5級根結(jié)(2.0～2.5 mm)、6級根結(jié)(2.5～3.0 mm)、7 級根結(jié)(>3.0 mm)。

1.2.5 石蠟切片法觀察根結(jié)線蟲的發(fā)育及統(tǒng)計線蟲體寬 具體參照李小曼[13]的方法,首先將取樣的根結(jié)放入FAA固定液中過夜固定，依次加入不同梯度的乙醇脫水，脫水后用二甲苯溶液使根結(jié)透明化。將透明好的根結(jié)充分浸潤石蠟，并使用熔融的石蠟包埋浸潤好的根結(jié)，待充分冷卻后進(jìn)行切片，用0.1%甲苯胺藍(lán)溶液染色。最后將染色后的載玻片用中性樹膠封上蓋玻片，待膠凝固后放在熒光正置顯微鏡下觀察并測量統(tǒng)計線蟲體寬，每個株系試驗重復(fù)數(shù)50個。

用Office Excel做數(shù)據(jù)記錄，采用SPSS多重比較法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，最后采用Office Excel和PhotoShopCS6繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄MYC2基因的生物學(xué)分析

對番茄中MYC2進(jìn)行了基礎(chǔ)信息分析。如圖1-A所示，MYC2僅包含1個外顯子，基因全長及CDS全長均為2070 bp，編碼689個氨基酸殘基。對MYC2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖1-B)后發(fā)現(xiàn)，番茄SLMYC2與擬南芥中的ATMYC4有較進(jìn)的進(jìn)化關(guān)系，ATMYC3和ATMYC4是SLMYC2的同源基因，故推測番茄中SLMYC2可能也參與植物防御反應(yīng)、次生細(xì)胞壁生物發(fā)生調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學(xué)功能。

A.番茄MYC2的基因結(jié)構(gòu)分析； B.番茄MYC2的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.2 番茄中MYC2影響南方根結(jié)線蟲入侵番茄后的根結(jié)數(shù)量

在CM和MYC2-CR株系接種南方根結(jié)線蟲7、 14、21 d后分別進(jìn)行取樣分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MYC2-CR株系的根結(jié)指數(shù)顯著低于CM對照株系(圖2)。對接種南方根結(jié)線蟲21 d 后的根結(jié)大小進(jìn)行分級，結(jié)果表明MYC2-CR株系的2、3、4級根結(jié)遠(yuǎn)少于CM對照株系(圖3)。因此說明在番茄中MYC2突變后可以顯著減少由南方根結(jié)線蟲侵染而形成的根結(jié)數(shù)量和根結(jié)大小。

圖2 南方根結(jié)線蟲入侵不同天數(shù)后番茄株系根結(jié)數(shù)量統(tǒng)計，*P<0.05

圖3 南方根結(jié)線蟲入侵不同天數(shù)后番茄株系根結(jié)分級，*P<0.05，** P<0.01

2.3 MYC2突變可以抑制南方根結(jié)線蟲入侵番茄后的生長發(fā)育

接種南方根結(jié)線蟲后，在前期7 d時、后期21 d時分別對CM和MYC2-CR兩個株系進(jìn)行根結(jié)取樣與石蠟切片觀察。結(jié)果表明(圖4和圖5)，接種南方根結(jié)線蟲后MYC2-CR株系中的根結(jié)線蟲體寬在7 d和21 d時均相比于CM株系小，尤其在接種21 d后MYC2-CR株系的統(tǒng)計結(jié)果相比于CM株系顯著減少。綜上可知，番茄中MYC2突變后對南方根結(jié)線蟲入侵后的生長發(fā)育具有一定的抑制作用。

▲.巨細(xì)胞；★.根結(jié)線蟲

圖5 CM和MYC2-CR株系中南方根結(jié)線蟲的線蟲體寬比較(*P<0.05)

3 討 論

本試驗以番茄CM野生型株系和MYC2敲除株系為材料，初步探究了番茄中MYC2調(diào)節(jié)番茄對南方根結(jié)線蟲敏感性的影響。在接種南方根結(jié)線蟲后，對線蟲根結(jié)進(jìn)行數(shù)量和大小統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)MYC2敲除株系的根結(jié)數(shù)量和大小均比CM野生型株系少；通過石蠟切片觀察分析根結(jié)內(nèi)線蟲的生長發(fā)育情況后可知，MYC2敲除株系根結(jié)內(nèi)的線蟲生長發(fā)育較野生型株系緩慢。綜上結(jié)果，MYC2敲除株系可以提高番茄對南方根結(jié)線蟲的抗性并且對南方根結(jié)線蟲的生長發(fā)育也具有一定的抑制作用。

在本試驗中探究出番茄中MYC2可以負(fù)向調(diào)節(jié)番茄對南方根結(jié)線蟲的敏感性，而這種結(jié)果似乎與番茄中MYC2在茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用并不相符。然而有研究發(fā)現(xiàn)MYC2轉(zhuǎn)錄因子在激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演核心角色, 可以參與以JA為核心的多種激素互作過程[14]。此外，Xu等發(fā)現(xiàn)獨(dú)腳金內(nèi)酯(SLs)在番茄防御根結(jié)線蟲中起到正調(diào)控作用，而在番茄中MYC2負(fù)調(diào)控番茄對根結(jié)線蟲的防御反應(yīng)，這可能是通過調(diào)節(jié)SLs、ABA和JA之間的激素交互來實現(xiàn)的[15]。Lorenzo等還發(fā)現(xiàn)在JA信號通路中，擬南芥中ATMYC2可以調(diào)節(jié)兩個分支反應(yīng)，分別是正向調(diào)控傷害相關(guān)基因的表達(dá)和負(fù)向調(diào)控病原菌相關(guān)基因的表達(dá)[16]。因此，我們推測番茄中MYC2的生物學(xué)功能具有多樣性，可能通過多種激素交互反應(yīng)來調(diào)控番茄對南方根結(jié)線蟲的防御反應(yīng)。綜合來說，本研究直接證明了在番茄中MYC2可以負(fù)向調(diào)節(jié)番茄對南方根結(jié)線蟲的敏感性，豐富了植物防御根結(jié)線蟲的免疫機(jī)制。