韋顯星，李 博，張翼鵬，丁 超，楊 金，彭 博，李夢(mèng)怡，卜春亞

(北京農(nóng)學(xué)院 生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)是一種世界性害螨，對(duì)農(nóng)業(yè)造成很大危害[1,2]。目前，對(duì)朱砂葉螨的防治有生物防治、農(nóng)業(yè)防治與藥劑防治等措施[3]，其中農(nóng)藥防治應(yīng)用最廣泛，但現(xiàn)有殺蟲劑存在影響非靶標(biāo)生物以及殘留等問(wèn)題。

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶[4]，是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥靶標(biāo)[5,6]。目前，乙酰膽堿酯酶抑制劑[7-9]，主要有植物源[10,11]、微生物源以及化學(xué)合成類[12,13]。隨著有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的大量使用，對(duì)哺乳動(dòng)物發(fā)育中的神經(jīng)的危害逐漸顯現(xiàn)[14]。鑒于對(duì)環(huán)境和人畜的危害以及朱砂葉螨對(duì)其抗性問(wèn)題，急需開發(fā)新型選擇型殺螨劑。

AChE的體外高效表達(dá)，在選擇性殺螨劑的研制中尤為重要。Lang[15]等比較了鱗翅類昆蟲的兩種AChE的抑制動(dòng)力學(xué)。Ilg[16]等表達(dá)了兩種蚤類AChE并測(cè)定抑制活性。Kim[17]等研究了馬鈴薯甲蟲AChE突變體的功能。彭博[18]等采用重組朱砂葉螨AChE篩選體外抑制化合物，但重組蛋白的活性還有待提高。在AChE抑制化合物的篩選中，重組蛋白具有特異性和重復(fù)性好、干擾少以及方便易得等特點(diǎn)，是較好的選擇。

此研究擬探究朱砂葉螨ace基因中疏水序列以及不同表達(dá)載體對(duì)其表達(dá)效果的影響，建立AChE體外高效表達(dá)純化體系，為抑制朱砂葉螨AChE活性化合物的篩選以及新型選擇性殺螨劑的研發(fā)提供試驗(yàn)指向。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株和載體：E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；ace原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30a/ace-1842(基因全長(zhǎng))由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：限制性內(nèi)切酶(EcoR Ⅰ、SalⅠ和XhoⅠ)、Primer STAR Max DNA Polymerase、dNTP購(gòu)自Takara公司，蛋白Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司，江蘇康為生化試劑有限公司的Cocktail蛋白酶抑制和One Step Western Kit HRP(rabbit)，TIANpure Mini Plasmid Kit、DNA Marker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，Ni-NTA購(gòu)自GE Healthcare，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司。

1.2 方 法

1.2.1 pET-30a/ace-1782、pCold Ⅱ/ace-1842和pCold Ⅱ/ace-1782原核表達(dá)載體的構(gòu)建 以保存的T/ace-1842質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特有引物(見表1)，F(xiàn)1、R1擴(kuò)增ace-1782(pCold Ⅱ)；引物F1、R2擴(kuò)增ace-1842(pCold Ⅱ)； F2、R1擴(kuò)增ace-1782(pET-30a)。PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收目的片段。

隨后，T4連接酶分別連接用限制性內(nèi)切酶消化的目的基因與空表達(dá)載體pCold Ⅱ和pET-30a，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，構(gòu)建pET-30a/ace-1782、pCold Ⅱ/ace-1842、pCold Ⅱ/ace-1782原核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切鑒定后，送測(cè)鑒定。

表1 不同形式ace基因擴(kuò)增引物

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)。挑取陽(yáng)性菌株單菌落活化并逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。pET-30a表達(dá)載體于37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6～0.8，加入終濃度1 mmol/L IPTG，28 ℃誘導(dǎo)7 h。pCold Ⅱ表達(dá)載體于37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.4～0.6，加入終濃度0.4 mmol/L IPTG，15 ℃誘導(dǎo)24 h。誘導(dǎo)后離心清洗并收集菌體，保存于-80 ℃待用。

1.2.3 目的蛋白的純化 誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，每升菌液用20 mL結(jié)合緩沖液A(2.7 mmol/L KCl、140 mmol/L NaCl、1.8 mmol/L KH2PO4、10 mmol/L Na2HPO4，pH 8.0)重懸，加入1 mmol/L PMSF、200 μL Cocktail蛋白酶抑制劑，冰上攪拌30 min。200 W功率破碎菌體140個(gè)循環(huán)。

將離心后的上清液與已平衡的Ni-NTA在4 ℃條件下結(jié)合2 h。用結(jié)合緩沖液和50 mM的咪唑緩沖液洗去未吸附和非特異性結(jié)合蛋白，用200 mmol/L的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白。收集流出峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)一步分析。用Amicon?Ultra-15濃縮并置換緩沖液，目的蛋白溶液于-80 ℃保存。

1.2.3 Western Blot分析 目的蛋白SDS-PAGE電泳后，100 V恒壓電轉(zhuǎn)2 h到PVDF膜上后，按照康為One Step Western Kit HRP(rabbit)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，室溫封閉PVDF膜5 min，本實(shí)驗(yàn)室制備的抗AChE特異性抗體孵育后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 BCA蛋白定量和酶活力測(cè)定 按照Thermo Scientific公司BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書，建立蛋白濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定各種AChE蛋白與螨粗提液的蛋白濃度。按文獻(xiàn)[1]制備螨粗提液。

按照改進(jìn)的Ellman法測(cè)定AChE重組蛋白活性[15]，以50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作為空白對(duì)照組；在試驗(yàn)組中加入100 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，80 μL相同濃度的各種AChE重組蛋白或螨粗提液。隨后每孔加入顯色劑DNTB(0.4 mmol/L DTNB，1.5 mmol/LNaHCO3) 20 μL和底物ATChI (1 mmol/L) 40 μL。室溫孵育后測(cè)定412 nm處吸光值。重復(fù)3次。

計(jì)算AChE重組蛋白與螨粗提液活性[19]，SPSS 19.0進(jìn)行活性差異顯著性分析。

分析AChE去掉疏水區(qū)對(duì)其表達(dá)效果的影響，比較AChE在pET-30a和pCold Ⅱ兩種表達(dá)載體中的表達(dá)效果。

1.2.5 毒扁豆堿對(duì)各種形式的AChE活性的抑制 96孔板中加入各種形式的 AChE分別和5個(gè)不同濃度梯度(終濃度為0～2 mM)的毒扁豆堿的預(yù)混液，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)孔。50 mM Tris-HCl(pH 8.0)作為空白對(duì)照， AChE作為陽(yáng)性對(duì)照，如上所述測(cè)定酶的剩余活性。利用SPSS 19.0卡方檢驗(yàn)計(jì)算毒扁豆堿對(duì)各種形式AChE的半數(shù)抑制濃度，進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形式ace原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pET-30a/ace-1782、pET-30a/ace-1842、pCold Ⅱ/ace-1782與pCold Ⅱ/ace-1842進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示，ace去疏水區(qū)以及野生型ace全長(zhǎng)分別構(gòu)建的pCold Ⅱ與pET-30a重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定結(jié)果正確，測(cè)序驗(yàn)證正確說(shuō)明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)表達(dá)。

注：M.DNA MarkerⅢ；1, 3.pCold Ⅱ/ace-1842；2.pCold Ⅱ/ace-1782；4.pET-30a/ace-1842；5.pET-30a/ace-1782

2.2 不同形式ace的誘導(dǎo)表達(dá)

將含 pET-30a/ace-1782、pET-30a/ace-1842、pCold Ⅱ/ace-1782和pCold Ⅱ/ace-1842陽(yáng)性質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株分別劃線培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，分別IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)情況，如圖2所示，與未誘導(dǎo)的相比，AChE重組蛋白去疏水區(qū)以及野生型全長(zhǎng)AChE重組蛋白在pCold Ⅱ與pET-30a載體中均得到成功表達(dá)，并且條帶大小均與預(yù)期一致?？傮w來(lái)說(shuō)，ace基因在 pCold Ⅱ載體中表達(dá)量要遠(yuǎn)高于pET-30a載體，相對(duì)表達(dá)量約為后者的7倍。

注：A.M.蛋白marker；1.未誘導(dǎo)的AChE-1842(pET-30a)；2.未誘導(dǎo)的AChE-1842(pCold Ⅱ)；3.未誘導(dǎo)的AChE-1782(pCold Ⅱ)；4.誘導(dǎo)后的AChE-1842(pET-30a)；5.誘導(dǎo)后的AChE-1842(pCold Ⅱ)；6：誘導(dǎo)后的AChE-1782(pCold Ⅱ)。B.M.蛋白marker；1.未誘導(dǎo)的AChE-1782(pET-30a)；2.未誘導(dǎo)的AChE-1782 (pCold Ⅱ)；3.誘導(dǎo)后的AChE-1782(pET-30a)；4.誘導(dǎo)后的AChE-1782 (pCold Ⅱ)

2.3 不同形式AChE重組蛋白的純化

Ni-NTA純化濃縮后，用SDS-PAGE分析和Western Blot檢測(cè)。如圖3所示， AChE重組蛋白去疏水區(qū)后的條帶以及野生型全長(zhǎng)AChE重組蛋白的條帶大小與預(yù)期一致，說(shuō)明AChE在pCold Ⅱ與pET-30a中表達(dá)成功，獲得的AChE蛋白符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

注：A.SDS-PAGE鑒定 M.蛋白marker；1.純化的AChE-1842(pCold Ⅱ)；2.純化的AChE-1782(pCold Ⅱ)； 3-4.純化的AChE-1842(pET-30a)；5.純化的AChE-1782(pET-30a)。B.Western-blot檢測(cè) M.蛋白marker；1.純化的AChE-1782(pCold Ⅱ)；2.純化的AChE-1842(pCold Ⅱ)； 3.純化的AChE-1842(pET-30a)；4-5.純化的AChE-1782(pET-30a)

2.4 不同形式AChE酶活力比較

采用ATCh-DNTB法測(cè)定AChE活性。如圖4所示，相同濃度水平下，AChE重組蛋白活性均顯著高于朱砂葉螨粗提液(P<0.05)。pCold Ⅱ和pET-30a兩種表達(dá)載體表達(dá)AChE時(shí)，pCold Ⅱ載體表達(dá)的AChE蛋白活性顯著高于pET-30a載體(P<0.05)，AChE重組蛋白在去掉疏水區(qū)后活性顯著提高(P<0.05)。

注：數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，柱上標(biāo)的不同小寫字母表示不同差異顯著水平(P<0.05)

2.5 各種AChE對(duì)毒扁豆堿的敏感性分析

隨著毒扁豆堿濃度的增加，AChE活性的逐漸下降，見圖5。SPSS計(jì)算得出，毒扁豆堿對(duì)重組朱砂葉螨AChE(pCold Ⅱ和pET-30a)的IC50分別為1.38 mM和1.79 mM。在pCold Ⅱ中表達(dá)的AChE比在pET-30a中表達(dá)的AChE對(duì)毒扁豆堿更加敏感(P<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明了在pCold Ⅱ中表達(dá)的AChE比在pET-30a中表達(dá)的AChE活性要高，為進(jìn)一步利用基因工程原理制備純化的螨AChE，為篩選新型農(nóng)藥和農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供了依據(jù)。

注：圖表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤

3 討 論

乙酰膽堿酯酶在昆蟲神經(jīng)信號(hào)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑通過(guò)阻斷AChE去極化而毒殺害蟲，隨著其對(duì)環(huán)境以及非靶標(biāo)有益生物毒性的日益顯現(xiàn)，研發(fā)以朱砂葉螨乙酰膽堿為靶標(biāo)的新型選擇性殺螨劑具有十分重要的實(shí)踐意義。目前，乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選通常使用螨粗提液，該方法存在不能排除螨自身其他蛋白對(duì)試驗(yàn)的影響等問(wèn)題。采用體外重組AChE蛋白，有助于解決這些問(wèn)題，可以大大提高篩選的效率。彭博[18]等采用螨AChE重組蛋白成功篩選到了有活性的殺螨化合物(毒扁豆堿的IC50為5.4 mM)，但AChE重組蛋白的活性還有待提高。與其相比本研究獲得的AChE對(duì)毒扁豆堿靈敏度提高3倍。

目前，已有多種物種的ace基因相繼表達(dá)成功。Fischer[20]等于1993年在大腸桿菌中表達(dá)了人乙酰膽堿酯酶。陳艷霞[21]于2007年克隆了家蠅乙酰膽堿酯酶并在昆蟲細(xì)胞成功表達(dá)。2009年Jiang[22]等采用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)了岡比亞蚊AChE1，并得到純化蛋白。昆明鼠AChE在原核表達(dá)載體pET28a中成功表達(dá)并進(jìn)行活性測(cè)定[23]。周小霞等[24]將東亞飛蝗的AChE在畢赤酵母中成功表達(dá)。彭博等[1]構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a/ace，獲得了有一定活性的螨AChE。大腸桿菌具有世代周期短、繁殖速度快、成本低以及遺傳背景清晰的特點(diǎn)，可以高效誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白，在基因工程中應(yīng)用廣泛[25]。但是原核表達(dá)體系表達(dá)真核生物蛋白時(shí)，由于缺少轉(zhuǎn)錄后加工，容易因蛋白折疊不正確而形成無(wú)活性的包涵體。pCold II表達(dá)載體具有使用方便和成本低等特點(diǎn)。蛋白的低溫誘導(dǎo)表達(dá)，有助于蛋白正確折疊，解決上述一些問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室曾將ace基因在真核表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO中進(jìn)行真核表達(dá)，但是表達(dá)量和純化量均不理想。鑒于真核細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)AChE蛋白表達(dá)量較低，以及pET系列原核表達(dá)載體表達(dá)AChE蛋白活性不是很理想等問(wèn)題。此研究對(duì)不同形式的AChE基因在兩種原核表達(dá)載體分別表達(dá)，通過(guò)比較表達(dá)量與活性水平的差異，篩選更為高效的AChE重組蛋白表達(dá)和純化體系，為抗AChE殺蟲劑的篩選奠定基礎(chǔ)。

結(jié)果表明AChE去掉疏水序列可以顯著提高酶的活性高于全長(zhǎng)序列，可見去掉疏水區(qū)的AChE蛋白增加了其水溶性，進(jìn)而增加了重組AChE蛋白的活性。和pET-30a載體表達(dá)的AChE相比，使用pCold II載體表達(dá)的AChE蛋白酶活性顯著增加，對(duì)毒扁豆堿的敏感性也大大提高?？梢妏Cold II的低溫冷表達(dá)系統(tǒng)有助于提高蛋白可溶性，進(jìn)而表現(xiàn)出更高的活性，是表達(dá)重組酶蛋白的較好選擇。AChE去掉疏水區(qū)后在pCold II表達(dá)載體中表達(dá)，獲得的重組蛋白可用于更高效、便捷地篩選朱砂葉螨乙酰膽堿酯酶抑制化合物的研究，為研制新型選擇性殺螨劑提供堅(jiān)實(shí)前期理論和試驗(yàn)技術(shù)支持。