宗召莉，郭 巍，趙 丹

(1.北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001)

昆蟲腸道是最易接觸到微生物的部位，昆蟲腸道菌群與昆蟲的生長發(fā)育息息相關(guān)。腸道微生物參與宿主各項生理活動，包括提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)宿主生長發(fā)育，降解有害物質(zhì)，保護(hù)宿主抵抗不利因子等[1]。然而，昆蟲在取食過程中也會攝入包括病原微生物在內(nèi)的復(fù)雜多樣的外來微生物，這可能會影響昆蟲正常的生命活動。維持腸道微生物菌群穩(wěn)定、抵抗外來病原菌對昆蟲生理生態(tài)的影響是至關(guān)重要的。為了保障宿主的正常存活，昆蟲腸道進(jìn)化出多種防御機制抵御外來微生物的入侵，其中雙重氧化酶(dual oxidase，Duox)介導(dǎo)的免疫機制是調(diào)節(jié)昆蟲腸道微生物穩(wěn)態(tài)的重要防御系統(tǒng)[2-3]。

雙重氧化酶是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族成員之一，在豬和人類的甲狀腺組織中首次得到鑒定[4-5]。Duox蛋白主要由過氧化物酶結(jié)構(gòu)域、鈣離子結(jié)合域、鐵還原結(jié)構(gòu)域、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域組成[6-7]。Duox與生物體的多種生理功能相關(guān)，參與人體甲狀腺激素的合成與釋放[8]；果蠅(Drosophilamelanogaster)Duox基因參與翅的合成和發(fā)育，在維持果蠅翅表面結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[6]。在岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)中腸Duox與過氧化物酶結(jié)合形成一層由共價鍵連接的二酪氨酸網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能降低免疫效應(yīng)因子對腸道的滲透[9]。斑馬魚(Daniorerio)腸道Duox可以清除傷口炎癥，幫助組織恢復(fù)完整性和穩(wěn)態(tài)[10]。

Duox具有調(diào)控腸道菌群的作用。斑馬魚中Duox基因在其腸道上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，敲除基因后腸道失去對沙門氏菌感染的控制作用[11]。Duox基因敲除型果蠅在感染條件下腸道中細(xì)菌無限增殖，表現(xiàn)出較高的易感性[12]。Ha等[13]研究表明，外來病原菌進(jìn)入果蠅腸道會分泌尿嘧啶，細(xì)胞膜上分布有G-蛋白偶聯(lián)受體，能識別尿嘧啶，并通過Ca2+把信號傳送到細(xì)胞內(nèi)激活Duox表達(dá)，釋放適量的ROS殺滅細(xì)菌。只有外來病原菌才能夠分泌尿嘧啶，而經(jīng)過長期協(xié)同進(jìn)化的宿主腸道共生菌喪失分泌尿嘧啶能力[14]，此種機制能保證宿主腸道很好的識別腸道共生菌和病原菌。Duox的基礎(chǔ)表達(dá)和活性對于昆蟲腸道防御機制至關(guān)重要。

棉鈴蟲屬于鱗翅目，夜蛾科，是一種世界性分布的多食性害蟲，也是中國棉田的主要害蟲，對多種農(nóng)作物造成巨大損失[15]。蘇云金桿菌作為應(yīng)用最廣泛的生物農(nóng)藥，在防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)和病原媒介昆蟲等方面發(fā)揮重要作用，此外，轉(zhuǎn)蘇云金桿菌作物也是目前種植最廣泛的轉(zhuǎn)基因作物[16]，系統(tǒng)研究昆蟲腸道免疫機制可為促進(jìn)蘇云金桿菌等生物農(nóng)藥的防治效果提供策略。筆者對棉鈴蟲HaDuox編碼區(qū)基因進(jìn)行克隆與表達(dá)，并分析其序列特征和該基因在不同發(fā)育階段及不同組織中的表達(dá)，并對棉鈴蟲在蘇云金桿菌誘導(dǎo)下HaDuox基因的免疫響應(yīng)進(jìn)行研究，分析HaDuox基因在棉鈴蟲抵御病原入侵中的作用，為進(jìn)一步揭示昆蟲腸道免疫機制奠定基礎(chǔ)，為尋找一種新的生防靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 供試材料 供試棉鈴蟲為北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)農(nóng)藥實驗室人工飼養(yǎng)種群，幼蟲以人工飼料飼養(yǎng)，成蟲飼喂10%白糖水。飼養(yǎng)條件為溫度27 ℃±1 ℃，濕度70%，光周期14 L∶10 D。蘇云金桿菌菌株SY80為北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)農(nóng)藥實驗室保存菌株，含有cry2Ah7和cry1Ia37基因。棉鈴蟲初孵第2天幼蟲飼喂4.8×1011CFU/mL的蘇云金桿菌SY80菌液72 h死亡率能達(dá)到70%，具有較高的殺蟲活性。pET-30a載體菌株為北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)農(nóng)藥實驗室保存。大腸桿菌EscherichiacoliDH5α，BL21感受態(tài)細(xì)胞購于北京華佰泰生物有限公司。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、PLB零背景快速克隆試劑盒、凝膠回收試劑盒購自TIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司；SYBR Premix Ex TaqTM、限制性核酸內(nèi)切酶購自Takara公司；TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity購自TransGen公司；T4 DNA連接酶購自Progema公司。所用引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成 棉鈴蟲幼蟲不同組織(頭部、表皮、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體)和不同發(fā)育時期(卵、1齡到5齡幼蟲、蛹)總RNA參照RNAprep Pure Tissue Kit說明書提取，瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop微量分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度。利用Thermo Scientific ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.2 棉鈴蟲HaDuox編碼區(qū)基因的克隆 從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載獲得棉鈴蟲HaDuox基因序列，利用DNAMAN設(shè)計RT-PCR引物，由于該基因序列過長，設(shè)計2對引物分別擴增基因前后兩段(1到2 248 bp、2 249到4 497 bp)，引物名稱為Duox1F & Duox1R和Duox2F & Duox2R，序列見表1，并通過overlap PCR技術(shù)拼接序列。利用設(shè)計的引物，以棉鈴蟲5齡幼蟲表皮cDNA為模板擴增目的基因，PCR反應(yīng)體系(50 μL)為5×PCR buffer 10 μL，dNTP Mix(10 μmol/mL)1 μL，上游引物2 μL、下游引物2 μL，模板cDNA 2 μL，High Fidelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)程序為94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，3.5 min；30個循環(huán)；72 ℃，10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后純化回收，連接到PLB零背景克隆載體并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定正確后送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 棉鈴蟲HaDuox基因序列分析 利用DNAMAN軟件分析HaDuox基因開放閱讀框及氨基酸序列，蛋白分子量(MW)及等電點(pI)。TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件進(jìn)行跨膜域預(yù)測，SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測，SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行功能域分析，MEGA5.0軟件對棉鈴蟲及多種昆蟲雙重氧化酶基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 HaDuox蛋白膜外部分編碼基因的原核表達(dá) 棉鈴蟲HaDuox蛋白為多次跨膜蛋白，選擇HaDuox蛋白膜外1 117到1 770 bp編碼基因進(jìn)行克隆及原核表達(dá)。根據(jù)原核表達(dá)載體pET-30a的多克隆位點，分別在上游引物和下游引物中引入酶切位點NdeⅠ和NotⅠ，引物名稱為YH-1F和YH-1R，序列見表1。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒PLB-HaDuox為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系同1.2.2。PCR反應(yīng)程序為94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，15 s；72 ℃，30 s；30個循環(huán)；72 ℃，10 min。產(chǎn)物連接到pET-30a載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。篩選構(gòu)建成功陽性菌株，并送北京六合華大基因科技有限公司測序。測序正確的重組菌株，用終濃度為0.8 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)在37 ℃，220 r/min條件下分別誘導(dǎo)1、2、4和6 h，以未加IPTG的菌體作為對照。SDS-PAGE檢測重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況，以小鼠抗6×His單克隆抗體(Mouse anti-6×His tag monoclonal antibody)(1∶5 000)為一抗，山羊抗小鼠IgG(Goat Anti-Mouse IgG)(1∶20 000)為二抗，進(jìn)行Western blot分析。

1.2.5 棉鈴蟲HaDuox的表達(dá)模式分析 利用熒光定量PCR分析棉鈴蟲不同發(fā)育時期和不同組織中HaDuox基因的轉(zhuǎn)錄水平。選擇棉鈴蟲β-actin基因作為內(nèi)參基因(GenBank登錄號：NW_018395562.1)，設(shè)計內(nèi)參基因引物Actin-F、Actin-R和目的基因引物qPCR-F、qPCR-R，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)為SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL，目的基因cDNA 2 μL，加ddH2O補足體系至20 μL。反應(yīng)程序為95 ℃，30 s；95 ℃，15 s；65 ℃，30 s；39個循環(huán)；65 ℃，10 min；每個反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)。利用2△△Ct=2-[(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)]處理組-[(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)]對照組公式計算相對表達(dá)量。用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，置信度95%時比較顯著性。

1.2.6HaDuox基因的病原誘導(dǎo)表達(dá)分析 LB固體平板劃線培養(yǎng)蘇云金桿菌SY80甘油菌，取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。第2天取新鮮菌液按1∶100的比例接種于400 mL 1/2 LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)直到大部分的晶體產(chǎn)生后收集孢晶混合物，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。選取長勢一致的棉鈴蟲3齡2 d幼蟲，停止喂食12 h使之處于饑餓狀態(tài)。涂布100 μL蘇云金桿菌SY80菌液(1.2×109CFU/mL)于飼料表面，風(fēng)干后進(jìn)行喂食。將供試?yán)ハx接種在涂布菌液的飼料上，以表面涂布等體積ddH2O的飼料為對照。每組接種30頭棉鈴蟲幼蟲，每個處理設(shè)置3組重復(fù)。飼喂1、3、6、12、18、24、36和48 h解剖收集棉鈴蟲腸道，分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR分析，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.5。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 棉鈴蟲HaDuox基因的克隆及序列分析

以棉鈴蟲5齡幼蟲表皮cDNA為模板，分別以Duox1F & Duox1R和Duox2F & Duox2R為引物進(jìn)行PCR擴增，得到HaDuox基因的前后兩段，產(chǎn)物大小分別為2 248 bp和2 249 bp。DNA純化試劑盒回收2個片段作為模板，以Duox1F和Duox2R為引物進(jìn)行重疊PCR，得到大小為4 497 bp的編碼區(qū)基因，命名為HaDuox(GenBank登錄號：MT150138)。HaDuox共編碼1 498個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為171.91 kD，等電點為8.90，為堿性蛋白；帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)160個，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)183個；穩(wěn)定性系數(shù)計算為41.71；親水性平均值為-0.221，表明該蛋白為親水性蛋白。SMART分析結(jié)構(gòu)域表明HaDuox與家蠶、橘小實蠅、意大利蜜蜂等昆蟲的Duox結(jié)構(gòu)域類似，含有過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，鈣離子結(jié)合域，鐵還原結(jié)構(gòu)域，黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域。TMHMM 2.0分析顯示有7個跨膜區(qū)，SignalP 4.1 Server預(yù)測顯示在第29個和第30個氨基酸位點之間存在一個信號肽切割位點，見圖1。

2.2 棉鈴蟲HaDuox系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)HaDuox編碼的氨基酸序列，利用NCBI中的Blast功能搜索其他昆蟲的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲H.armigeraHaDuox與鱗翅目夜蛾科的斜紋夜蛾SpodopteralituraSlDuox編碼的(GenBank登錄號：XP_022813998)氨基酸相似性最高，達(dá)98.84%；其次是鱗翅目夜蛾科粉紋夜蛾Trichoplusiani的TnDuox(GenBank登錄號：XP_026735041.1)，序列相似性為97.91%；再之后是亞洲玉米螟OstriniafurnacaliOfDuox(GenBank登錄號：XP_028176585.1)，序列相似性為95.05%；與煙草天蛾ManducasextaMsDuox(GenBank登錄號：XP_030030662.1)，家蠶BombyxmoriBmDuox(GenBank登錄號：XP_021207538.1)，夏威夷紅蛺蝶VanessatameameaVtDuox(GenBank登錄號：XP_026499659.1)和金鳳蝶PapiliomachaonPmDuox(GenBank 登錄號：XP_014367406.1)的序列相似性分別為94.81%、94.43%、94.74%、93.81%。

從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索來自鱗翅目、鞘翅目、雙翅目的14種昆蟲的Duox基因的氨基酸序列，與棉鈴蟲HaDuox的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。棉鈴蟲H.armigera與鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾S.litura、粉紋夜蛾T.ni、海波斯莫科馬屬蛾Hyposmocomakahamanoa、亞洲玉米螟O.furnacalis、水稻二化螟Chilosuppressalis、煙草天蛾M.sexta、家蠶B.mori、金鳳蝶P.machaon聚為一支，親緣關(guān)系較近，其中棉鈴蟲與斜紋夜蛾的親緣關(guān)系最近，與鞘翅目和雙翅目昆蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

注：A代表HaDuox蛋白含有7個跨膜域；B為HaDuox蛋白結(jié)構(gòu)域分析；C中下劃線表示信號肽

圖2 基于氨基酸序列構(gòu)建的昆蟲Duox系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 棉鈴蟲HaDuox蛋白膜外部分編碼基因的原核表達(dá)

HaDuox膜外1 117到1 770 bp編碼基因與pET-30a載體連接，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切驗證重組載體構(gòu)建成功(圖3)，重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，驗證正確的重組菌經(jīng)0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，在37 ℃，220 r/min進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)。

取誘導(dǎo)0、1、2、4和6 h的菌液進(jìn)行檢測。SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果顯示，誘導(dǎo)1、2、4和6 h均有約25.26 kD大小的蛋白表達(dá)，結(jié)果見圖4。

2.4 棉鈴蟲HaDuox的表達(dá)模式分析

實時熒光定量PCR分析HaDuox在棉鈴蟲5齡幼蟲不同組織和棉鈴蟲不同發(fā)育時期的相對表達(dá)量。HaDuox在棉鈴蟲各組織中均有轉(zhuǎn)錄，其中馬氏管中的表達(dá)量最高，表皮中的表達(dá)量僅次于馬氏管，頭部的表達(dá)量最低(圖5-A)。HaDuox在棉鈴蟲不同發(fā)育時期均有轉(zhuǎn)錄，其中卵期表達(dá)量較高，幼蟲期表達(dá)量較低(圖5-B)。

注：M是DL10000 DNA marker；1是pET-30a-HaDuox-p質(zhì)粒雙酶切；2是pET-30a載體雙酶切

注：M是蛋白Marker；1是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液；2-5是菌液經(jīng)IPTG分別誘導(dǎo)1、2、4和6 h

注：A為HaDuox在棉鈴蟲不同組織中的表達(dá)量；B為HaDuox在棉鈴蟲不同齡期的表達(dá)量；圖中的不同字母表示顯著差異(P<0.05)

2.5 棉鈴蟲HaDuox的病原誘導(dǎo)分析

利用實時熒光定量PCR分析蘇云金桿菌SY80菌液對棉鈴蟲HaDuox相對表達(dá)量的影響。棉鈴蟲取食該蘇云金桿菌菌株后，與對照組相比，其腸道中HaDuox的表達(dá)量6 h時保持穩(wěn)定，取食12、18和24 h后，HaDuox表達(dá)量顯著增加，18 h和24 h較之前稍有下降，直至36 h恢復(fù)正常水平(圖6)。這表明蘇云金桿菌SY80菌液可以經(jīng)口進(jìn)入棉鈴蟲體內(nèi)通過腸道感染昆蟲，入侵宿主后能誘導(dǎo)宿主腸道HaDuox表達(dá)水平增加，推測棉鈴蟲通過產(chǎn)生腸道免疫響應(yīng)以抵抗蘇云金桿菌的侵染。

注：圖中的不同字母表示樣品存在顯著差異(P<0.05)

3 討 論

本研究通過RT-PCR技術(shù)成功克隆棉鈴蟲Duox基因編碼區(qū)序列，命名為HaDuox。其開放閱讀框大小為4 497 bp，編碼1 498個氨基酸。相似性分析發(fā)現(xiàn)HaDuox與鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾、粉紋夜蛾和亞洲玉米螟的相似性較高，達(dá)到了95%以上。功能域預(yù)測表明HaDuox蛋白含有過氧化物酶結(jié)構(gòu)域，鈣離子結(jié)合域，鐵還原結(jié)構(gòu)域，黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合域，與家蠶、橘小實蠅、意大利蜜蜂和斑馬魚等多種物種相似，說明這類結(jié)構(gòu)在物種間十分保守[11,17-19]。HaDuox共有7個跨膜區(qū)，其數(shù)量又與果蠅、橘小實蠅等Duox完全相同[13,19]，Duox在物種間高度保守，推測其行使的功能也是非常保守的。馬振剛等[18]研究表明，家蠶BmDuox可以幫助抵御家蠶微孢子蟲；橘小實蠅BdDuox基因的沉默可導(dǎo)致宿主腸道細(xì)菌菌群密度、結(jié)構(gòu)及細(xì)菌群落多樣性改變[19]；果蠅敲除雙重氧化酶基因在腸道感染條件下不能有效清除外來微生物，對于腸道感染高度敏感[20]；斑馬魚Duox能抵抗沙門氏菌感染[10]。由此可見，棉鈴蟲HaDuox可能在抵御昆蟲腸道病原微生物，維持腸道菌群平衡的過程中發(fā)揮作用。

完整的HaDuox基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)長為4 497 bp，編碼1 498個氨基酸，全長基因的體外表達(dá)難度較大，試圖利用原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)完整的HaDuox蛋白，但均未取得成功。選擇HaDuox基因N端膜外蛋白區(qū)1 117到1 770 bp的核苷酸序列進(jìn)行原核表達(dá)，預(yù)測蛋白分子量為25.26 kD，表達(dá)的產(chǎn)物與預(yù)測蛋白大小一致。HaDuox蛋白的膜外片段在大腸桿菌中成功表達(dá)，有助于實現(xiàn)對蛋白的純化，并為后續(xù)以其為抗原制備多克隆抗體研究蛋白在組織中的定位和功能分析奠定基礎(chǔ)。

對HaDuox的表達(dá)模式研究，其在棉鈴蟲的不同組織中均有表達(dá)，表明棉鈴蟲雙重氧化酶HaDuox可能在蟲體中行使多種功能。HaDuox在馬氏管的轉(zhuǎn)錄水平較高，推測其可能參與棉鈴蟲的排泄功能，這與在大鼠中的發(fā)現(xiàn)較為一致，在大鼠的結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)Duox的較高表達(dá)[21]。從其整個發(fā)育階段來看，在各個發(fā)育階段均有表達(dá)，證明其參與棉鈴蟲整個生活史。棉鈴蟲受蘇云金桿菌SY80侵染6 h之內(nèi)，HaDuox的表達(dá)水平為基礎(chǔ)水平，12 h mRNA的表達(dá)水平激增，提示蘇云金桿菌侵染棉鈴蟲后宿主能夠?qū)ζ溥M(jìn)行識別，并調(diào)控HaDuox表達(dá)量，從而形成棉鈴蟲腸道對蘇云金桿菌入侵的防御機制。本研究采用的蘇云金桿菌SY80菌株含有cry2Ah7和cry1Ia37基因，對棉鈴蟲具有較高的生物活性，是棉鈴蟲的重要病原，能誘導(dǎo)HaDuox對其進(jìn)行響應(yīng)，其他對棉鈴蟲活性較低的蘇云金桿菌菌株是否具有相同的誘導(dǎo)效果，仍需進(jìn)一步研究。

近些年來，已有多種害蟲對蘇云金桿菌產(chǎn)生抗性問題，抗性發(fā)展成為蘇云金桿菌應(yīng)用的潛在威脅，亟待找出新的辦法延緩蘇云金桿菌抗性。通過對Duox基因的序列特征、表達(dá)模式和病原誘導(dǎo)進(jìn)行分析，深入理解Duox-ROS免疫在昆蟲腸道免疫中的重要作用及昆蟲響應(yīng)蘇云金桿菌侵染的分子機制，為后續(xù)利用RNAi技術(shù)沉默昆蟲腸道防御關(guān)鍵基因結(jié)合蘇云金桿菌殺蟲劑的防治方法提供新的思路。