馬宗桓，毛 娟，魏居燦，褚明宇，李文芳，周 琪，楊始錦，陳佰鴻

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省白龍江林業(yè)管理局南華生態(tài)建設局，甘肅 張掖 734000)

氮肥和光合作用之間的關系已有許多研究[1-2]，為了保持作物的自然光合作用，>50%的氮被分配給光合器官[3]。氮素是果樹生長發(fā)育最重要的礦質(zhì)元素之一，能夠影響果樹生長中的各個環(huán)節(jié)，尤其是對果樹光合生理的影響[4]。氮素能夠影響果樹葉片的氣孔結(jié)構(gòu)，改變?nèi)~片中的氮含量、葉綠素含量以及各種酶的活性[5]。合理施用氮肥可以提高葉片的光合效率，反之，則不利于葉片進行光合作用[6]。梁燕[7]的研究表明，富士幼苗在單株施入0～9 g的氮素水平范圍內(nèi)，植株葉片的光合指標隨著氮素水平的升高而增加，之后隨著氮素水平的提高反而下降。葉綠素熒光特性可以反映葉片光合系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配[8]。研究表明，氮素對葉綠素熒光特性有顯著影響，施氮處理非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)顯著低于不施氮處理，增施氮素增大葉片PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量(Fv/Fm)和葉片PSⅡ活性(Fv/Fo)，促使植物捕獲光能和熱耗散增加，光抑制減弱[9]。適宜的施氮量能顯著促進葉片葉綠素的合成，提高光合速率、PSⅡ光化學最大效率和實際光化學效率[6]。人們在生產(chǎn)上主要通過合理施用氮肥來增強植物的光合生產(chǎn)性能。研究表明，改善作物光合生產(chǎn)率是提高產(chǎn)量和品質(zhì)的生理基礎[10-11]。

激素在影響植物生長發(fā)育時不是單一發(fā)揮作用，而是通過相互之間的協(xié)調(diào)平衡或是拮抗競爭來實現(xiàn)。植物可以正常開花結(jié)果，各種激素之間的比例必須達到某種協(xié)調(diào)或平衡才能實現(xiàn)[12-13]。例如細胞分裂素和生長素的比值對芽的分化和生長有著重要的調(diào)節(jié)作用，比值較高對花芽分化和生長作用明顯[14]。氮素能夠調(diào)節(jié)植物激素的生物合成，Kiba等[15]提出根際、根內(nèi)氮狀況信號以及地上部植株營養(yǎng)狀況信號是通過細胞分裂素途徑和生長素信號途徑傳導，二者的相互作用調(diào)控植物根系的生長發(fā)育與氮素吸收。蘋果中研究發(fā)現(xiàn)，在整個生長期內(nèi)葉片的ABA含量和淀粉在不施氮肥的情況下含量最高，而淀粉積累量與果樹成花顯著相關，不同氮水平下ABA合成差異也會造成樹體光合產(chǎn)物的分配與貯藏形態(tài)的差異[16]。

目前，氮素在植物生長及光合生理方面的研究已經(jīng)比較廣泛，本研究主要在前期工作的基礎上，探討不同生育期施入氮素對葡萄葉片光合生理及內(nèi)源激素水平的影響，以期為葡萄氮素合理施用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

田間試驗于2016—2017年在武威市黃羊鎮(zhèn)莫高葡萄酒原料基地進行，連續(xù)2 a按照試驗設計進行水肥管理，并對葉片光合及熒光參數(shù)進行了測定，第2年試驗進行內(nèi)源激素水平的測定。試驗基地土壤為中性到弱堿性的礫質(zhì)沙壤土，土層深厚，透氣好，年降雨量191 mm，蒸發(fā)量2 130.8 mm，年平均日照時數(shù)為2 724.8 h，≥10℃的有效積溫在2 800℃～3 200℃，年平均溫度6.9℃，氣候涼爽，無霜期160 d，生長期光照充足，晝夜溫差大。土壤有機質(zhì)為6.2 g·kg-1，pH值7.8，速效氮0.9 g·kg-1，速效磷22 mg·kg-1，速效鉀123 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗所用材料為10 a生釀酒葡萄‘蛇龍珠’，單籬架，樹形為多主蔓扇形，株行距為1 m×3 m。每株葡萄留5個主蔓，在新梢生長至1 m左右時摘心，及時疏除果穗以下的副梢，頂端2個副梢留4葉摘心，其它副梢均單葉摘心。采用滴管灌溉，尿素隨水施入，葡萄植株兩側(cè)開溝分別施入過磷酸鈣750 kg·hm-2，硫酸鉀825 kg·hm-2，過磷酸鈣在出土后第1次灌水前施入，硫酸鉀在果實轉(zhuǎn)色期施入。滴灌帶為酒泉大禹節(jié)水有限公司生產(chǎn)，壁厚0.2 mm，滴孔間距30 cm，單孔出水量3 L·h-1，灌水量及時間參照“武威莫高釀造葡萄滴灌配水定額表[11]”進行，在試驗中根據(jù)實際情況有所調(diào)整。試驗共設置21個小區(qū)，每小區(qū)為一個處理，設置3個生物學重復，各處理隨機分布。小區(qū)長80 m，寬60 m，面積為240 m2，每個小區(qū)定植40株葡萄，取樣時不在同一棵葡萄樹上重復取樣?！啐堉椤咸言谠摰貐^(qū)的主要生育期見表1。

不同生育期施入等量氮肥，氮素分別在萌芽前(S1，4月25日)、新梢旺長期(S2，5月15日)、開花期(S3，6月5日)、果實第一次膨大期(S4，6月25日)和副梢生長旺期(S5，7月20日)一次性施入300 kg·hm-2尿素。為對照整個生育期均不施氮肥(CK)。分別于7月25日(花后50 d，DAF50)、8月29日(花后85 d，DAF85)和10月3日(花后120 d，DAF120)進行各項指標的測定并取樣。光合及熒光相關參數(shù)于晴天上午9∶00～11∶00進行，測定時每個處理選取新梢從基部向上第4～5節(jié)位葉30片，測定SPAD值及光合熒光相關參數(shù)，然后摘除葉片，去除葉脈后稱取5 g在液氮中速凍后置于超低溫冰箱保存，每處理設置3個生物學重復，取樣時在同一植株上不重復取樣。

表1 ‘蛇龍珠’葡萄在武威地區(qū)的主要生育期

1.2 測定項目與方法

1.2.1 葉綠素含量及光合熒光參數(shù)測定 葉綠素相對含量使用SPAD502葉綠素儀進行測定。凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)使用便攜式光合系統(tǒng)(CIRAS-2, PP-system, UK)進行測定。測定時相對濕度保持在75%，空氣CO2濃度為380 mol ·mol-1，葉片溫度保持在25℃，光量子通量密度調(diào)整為1 000 mol·m-2·s-1。葉片熒光參數(shù)用便攜脈沖調(diào)制式熒光儀(FMS-2, Hansatech, UK)測定。

1.2.2 內(nèi)源激素的提取 將冷凍的葉片在液氮中快速研磨成粉末，用10 mL 80%的色譜甲醇(超純水配制)分3次洗入15 mL離心管中，放4℃冰箱中浸提24 h，期間每隔1 h震蕩混勻1次，1 000 r·min-1離心15 min。吸取上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮除去甲醇，得到約2 mL的濃縮液，用50%的甲醇沖洗蒸發(fā)瓶瓶壁，最后定容至10 mL，用一次性針管吸取2 mL過0.22 μm有機膜，裝入1.5 mL的離心管放入冰盒中避光保存，測定玉米素(ZT)、生長素(IAA)和脫落酸(ABA)含量。赤霉素(GA3)的浸提液為乙腈，提取步驟與前面一致。

1.2.3 內(nèi)源激素的測定 液相色譜儀型號為Agilent 1100 series，檢測器為vwd，色譜柱為Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為色譜甲醇和超聲后0.6%的冰乙酸(0 min，甲醇∶乙酸=40∶60；11.9 min，甲醇∶乙酸=40∶60；12 min，甲醇∶乙酸=50∶50)，流速為1.0 mL·min-1，波長為254 nm，柱溫25℃。進樣量為10 μL，標樣均為美國Sigma產(chǎn)品，取各濃度的混標溶液進行液相色譜分析后繪制標準曲線。采用外標法進行樣內(nèi)源激素含量的確定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Microsaft Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan法進行方差分析，Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮時期對葡萄葉片光合作用的影響

與對照相比，不同時期施氮肥均顯著增加了葉片Tr水平(表2)，S2處理葉片Tr在3個時期均最高。S1處理除2017年在DAF50時葉片Tr與S2無顯著差異外，其他生育期S1處理Tr均顯著低于S2，在DAF85時，S3處理葉片Tr與S2無顯著差異。S4處理葉片Tr均顯著高于CK，在DAF50和DAF120時，S5和CK葉片Tr無顯著差異，DAF85時，S5顯著高于CK。

從表3測定結(jié)果來看，S2處理葉片Gs增加最為顯著，除S3處理在2016年DAF85時Gs與S2處理無顯著差異外，其余各生育期Gs均顯著高于其他處理。S1和S3處理各個生育期Gs無顯著差異。相比其他處理，S5處理在各生育期Gs較小，在DAF50和DAF85時S5處理與對照無顯著差異，DAF120時顯著高于對照。

由表4可知，施氮處理降低了葉片Ci，2016、2017年中CK和S1處理葉片Ci均最高。DAF50和DAF85時，2016年和2017年S1、S2和S5處理間Ci無顯著差異，同樣，2016年的DAF120時，S1、S2和S5處理間Ci無顯著差異，而2017年S1處理Gi顯著高于S2和S5。S3和S4處理在2 a中葉片發(fā)育的各時期Gi均無顯著差異。

由表5可以看出，葉片Pn在DAF85達到了最高，并且在DAF120時下降。不同時期施氮均增加了各生育期葉片Pn，CK葉片Pn最小。S1、S2和S3處理對各生育期葉片Pn的增加較為顯著，S2和S3處理在2016和2017年各生育期Pn差異均不顯著。

表2 施氮時期對不同生育期葡萄葉片蒸騰速率(Tr)的影響/(mmol·m-2·s-1)

表3 施氮時期對不同生育期葡萄葉片氣孔導度(Gs)的影響/(mol·m-2·s-1)

表4 施氮時期對不同生育期葡萄葉片胞間CO2濃度(Ci)的影響/(μmol·mol-1)

表5 施氮時期對不同生育期葡萄葉片凈光合速率(Pn)的影響/(μmol·m-2·s-1)

2.2 施氮時期對葡萄葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

由表6可知，不同時期施氮提高了葉片ФPSⅡ，S1、S2和S3處理ФPSⅡ顯著高于S4、S5處理及CK，可見，生育前期施氮有利于葉片ФPSⅡ的增大。S1和S2處理，S4和S5處理的ФPSⅡ分別在2016年和2017年的各生育期均無顯著差異，S2處理在2016年的DAF50和DAF120時顯著高于S3處理，其他時期兩個處理間無顯著差異。CK的ФPSⅡ最低，在DAF50時與S5處理無顯著差異，而在DAF120時顯著低于S5處理。

S1、S2和S3處理葉片F(xiàn)v/Fm在各生育期均無顯著差異(表7)，可見，這3個時期施氮肥對Fv/Fm的影響較小。CK葉片F(xiàn)v/Fm值顯著小于各施氮處理，不施氮肥顯著降低Fv/Fm。S4和S5處理Fv/Fm在2016年差異顯著，而在2017年兩個處理間差異不顯著。

由表8可知,2016年和2017年，S2處理在各生育期qP均最高，S1和S3處理在DAF50和DAF85時qP無顯著差異，2016年S1處理qP顯著高于S3，而2017年二者無顯著差異。DAF50時S4和S5處理間qP無顯著差異，且均顯著高于CK，DAF85和DAF120時除S5處理在2016年qP與對照無顯著差異外，其他各處理均顯著高于CK。

S1～S5處理中,隨施氮時期的后移NPQ增大，S5和CK間NPQ無顯著差異，在各生育期NPQ均較高，S4除2017年的DAF85時顯著低于CK外，其他均與S5和對照無顯著差異(表9)。DAF50時，S3處理NPQ顯著高于S1和S2；DAF85時，2016年S2和S3處理NPQ無顯著差異，而S3顯著高于S1，2017年S1、S2和S3處理均無顯著差異；DAF120時，連續(xù)兩年測得NPQ在S1、S2和S3處理之間無顯著差異。

2.3 施氮時期對葡萄葉片內(nèi)源激素含量的影響

不同時期施氮對葡萄葉片ZT含量的影響如圖1A，不同時期施氮對不同生育期葉片內(nèi)源激素水平的影響不同。DAF50時S4處理葉片中ZT含量顯著高于其他各處理，S3、S4和S5葉片ZT含量顯著高于對照，分別是對照的1.27倍、1.46倍和1.10倍。DAF85時，S1葉片中ZT含量顯著高于對照，是對照的1.6倍，S3和S4處理葉片中ZT含量無顯著差異，均顯著高于對照，S5處理和對照差異不顯著。DAF120時，與對照相比，各施氮處理促進了葉片中ZT的積累，S1、S2和S5處理對葉片中ZT含量的增加效果最為顯著，分別是對照的1.57倍、1.52倍和1.58倍，且3個處理間無顯著差異，S3和S4間無顯著差異，但均顯著高于對照。

表6 施氮時期對不同生育期葡萄葉片ФPSⅡ的影響

表7 施氮時期對不同生育期葡萄葉片F(xiàn)v/Fm的影響

表8 施氮時期對不同生育期葡萄葉片qP的影響

與DAF50時相比，在DAF85和DAF120時葉片IAA含量升高(圖1B)，DAF50時，S4葉片中IAA含量最高，為27.38 μg·g-1，顯著高于其他處理。S1、S2和S3處理葉片IAA含量均顯著低于對照，S5處理和對照無顯著差異。DAF85時，S1、S2、S3、S4和S5處理葉片IAA含量均顯著高于對照，S2處理IAA含量最高，為34.70 μg·g-1，S1、S3、S4和S5處理葉片中IAA含量無顯著差異。DAF120時，S1和S2處理葉片IAA含量和對照無顯著差異，均顯著低于S3、S4處理和S5處理，S3、S4處理和S5處理顯著促進了葉片中IAA含量的積累，在該生育期IAA含量均顯著高于對照，分別為35.41、35.60 μg·g-1和36.99 μg·g-1(圖1B)。

DAF50時，S1、S2、S3、S4和S5處理葉片ABA含量顯著高于對照，S1、S2、S3和S4處理間無顯著差異，但均顯著高于S5處理。DAF85時，S1、S2和S4處理葉片中ABA含量分別為6.25、6.33 μg·g-1和5.39 μg·g-1，顯著低于對照及其他施氮處理，S3和S5處理葉片中ABA含量與對照無顯著差異。DAF120時，對照葉片中ABA含量顯著高于各施氮處理，S1、S4和S5處理葉片ABA含量無顯著差異，S3處理葉片ABA含量為5.74 μg·g-1，顯著低于對照和各施氮處理(圖1C)。

由圖1D可知，葡萄葉片中GA3含量隨葉片發(fā)育逐漸減少，DAF50時，施氮處理葉片GA3含量顯著高于CK，S3、S4和S5處理葉片GA3含量無顯著差異，分別是對照的2.16倍、2.25倍和2.17倍。DAF85時，各施氮處理均顯著增加了葉片中GA3的含量，S1、S2、S3、S4和S5處理葉片中GA3含量分別為7.05、8.2、8.44、8.82 μg·g-1和7.82 μg·g-1，其中S4處理葉片中GA3含量最高，是對照的2.71倍。DAF120時，葉片中GA3含量下降，施氮處理葉片中GA3含量顯著高于對照，其中，S1、S2和S3處理在該生育期GA3含量無顯著差異，S4處理葉片中GA3含量最高，是該時期對照的1.63倍。

表9 施氮時期對不同生育期葡萄葉片NPQ的影響

注：不同小寫字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)。Note: The different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05)．圖1 施氮時期對葡萄葉片內(nèi)源激素水平的影響Fig.1 Effects of nitrogen application timing on endogenous hormone levels in grape leaves

3 討 論

植物主要通過光合作用積累干物質(zhì)，光合作用可直接影響植物的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)形成。影響光合作用的因子很多，比如光照、水分、CO2濃度、溫度和礦質(zhì)元素等[17-19]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，影響植株生長和干物質(zhì)積累的因素還有土壤水分和氮素，不同的土壤水分含量和氮素水平影響植物的光合能力，從而直接影響植株的生產(chǎn)能力[20]。研究發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)隨著施氮量的增加葉片凈光合速率顯著提高[17]。另外，研究發(fā)現(xiàn)適當推遲施氮時期有利于提高葉片凈光合速率，延緩葉片衰老，延長光合時間[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同時期施氮均能增加葉片凈光合速率，在花前施氮肥效果最為顯著，能夠顯著延長光合時間。同時，在副梢生長旺期前施氮肥葉片Gs和Tr也顯著高于對照，Ci與之相反。研究表明，氮素有利于葉片Gs的增加，主要是由于氮素通過調(diào)控植物對鉀元素的吸收增加所致，空氣動力學研究結(jié)果認為鉀素能夠調(diào)節(jié)氣孔的開張[8]。茶樹中的研究結(jié)果表明，施氮通過增加葉片的Pn、Gs和Tr，降低Ci以促進茶樹的生長[6]，本研究的結(jié)果與之相同。從本研究中新梢旺長期和開花期施氮肥Pn、Gs和Tr相對高于其他各生育期施氮，因此，認為這兩個生育期施氮能夠改善葡萄葉片光合性能，增加光合同化能力。

與表觀的光合指標相比，葉綠素熒光特性能夠反映植物葉片光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配，通過葉片的熒光特性可以分析植物生長狀況及生理狀態(tài)[22]。研究表明，施氮量的提高會增加葉片的qP，而顯著降低NPQ[23]。Fv/Fm代表了PSⅡ的最大光化學效率，能反映植物對光能的利用效率，本研究中，施氮增加了葉片的ФPSⅡ、Fv/Fm和qP，而NPQ相反，可見氮素改變了葉片熒光參數(shù)，從而促進葉片的光合作用。果實第一次膨大期之前施入氮肥對葉片ФPSⅡ和qP的增加最顯著，副梢生長期施氮肥和對照的NPQ在各生育期最高。萌芽期、新梢旺長期和開花期施氮肥對葡萄各生育期ФPSⅡ、Fv/Fm和qP的增加顯著，從而增加葉片的光合同化能力。

施氮時期可通過影響植物體內(nèi)的內(nèi)源激素水平變化而對植物的生長發(fā)育起作用。研究表明，氮素可以調(diào)節(jié)植物根系形態(tài)生理及構(gòu)型，進而影響植物地上部分的生長發(fā)育和養(yǎng)分吸收及利用[24]。研究表明，施氮量增加會增加植株體內(nèi)促進型激素含量，但ZT/GA和ABA/GA比值逐漸減低，氮肥利用率顯著降低[25]。氮肥和鉀肥供應充足時有利于植物根系和地上部分的生長，細胞分裂素合成增加，ABA分解加快，延緩植物衰老，當植物缺素或者養(yǎng)分不足時則相反[26]。本研究發(fā)現(xiàn)氮素施用時期不同，葡萄不同生育期葉片的內(nèi)源激素水平不同，和不施氮肥相比，DAF85后施氮肥均顯著提高了葉片ZT含量。花后施入氮素葉片IAA含量在果實采收時保持較高的水平，在果實第一次膨大期和新梢旺長期施氮肥GA3含量最高?？梢?，施入氮素會促使促進生長型激素含量的增加，施氮時期延后，對采收后葉片功能保持具有積極作用。施入氮素降低了采收時葡萄葉片的ABA含量，新梢旺長期和花期施氮對ABA含量減少最為顯著。因此，施氮也減少了葡萄生育后期抑制生長型激素含量，從而延長葉片光合同化時間。本研究中發(fā)現(xiàn)，在DAF50時，施氮處理葉片中ABA含量顯著高于對照葉片ABA含量，而在果實采收時對照處理與施氮處理相比，葉片ABA含量顯著升高。有研究表明，ABA能夠促進植株保衛(wèi)細胞的氣孔關閉以維持植株內(nèi)的水分[27]，在DAF50時，河西走廊地區(qū)氣溫達到全年最高的時段，氮素促進葉片ABA含量增加可能與葉片水分保持有關。

4 結(jié) 論

本試驗主要研究不同生育期施入氮素對釀酒葡萄葉片光合及熒光特性、內(nèi)源激素水平的影響，與CK相比，新梢旺長期和開花期施氮葉片Tr、Gs和Pn分別提高4.3%、2.1%和9.3%以上，Ci顯著降低；萌芽期、新梢旺長期和開花期施氮肥葉片ФPSⅡ、Fv/Fm和qP與CK相比增加量在1.5%～11.7%之間，NPQ降低；同時，不同生育期施氮肥有利于促進生長型激素的積累，而降低采收期葉片ABA的增加。