武軍艷，馬 驪，方 彥，張亞宏，馬學(xué)才，劉麗君，牛早霞，李學(xué)才，李愛國，孫萬倉

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070;2. 甘肅天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 天水 741001；3. 河北省農(nóng)作物抗旱研究實驗室，河北 衡水 053000)

白菜型冬油菜是一種新選育的強冬性油菜，可在極端低溫為-20℃～-32℃的地區(qū)種植[1-2]，它的成功選育使得我國北方地區(qū)農(nóng)田冬季具有了覆蓋作物，為北方耕作制度改革帶來益處。在我國北方，冬油菜于8月中旬—9月上旬播種，次年3月中、下旬返青，5月下旬開始收獲，收獲后可復(fù)種其他作物(玉米、馬鈴薯、向日葵、蕎麥、蔬菜等)，具有顯著的經(jīng)濟效益。其次，種植冬油菜可充分利用北方的光熱資源，將北方傳統(tǒng)的一年一熟模式轉(zhuǎn)變?yōu)閮赡耆炷Ｊ絒3]，增加冬季土地覆蓋，避免春耕，減少農(nóng)田土壤表面灰塵[4]，而農(nóng)田表面灰塵是沙塵暴沙塵的重要來源。

脫落酸(Abscisic acid，ABA)與植物的多種抗逆性有關(guān)[5]。在高等植物中，ABA生物合成主要通過間接途徑進行，在此合成途徑中有多種酶參與[5]，其中9-cis環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(NCED)基因是關(guān)鍵的限速基因[6-7]。因此，在許多植物中NCED均被克隆[8-11]。擬南芥基因組中編碼NCED的同源基因有9個，其中AtNCED3基因的表達可由干旱脅迫誘導(dǎo)[12]；AtNCED3過表達可提高轉(zhuǎn)基因植物對脫水脅迫的耐受性，這表明AtNCED3的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)了ABA在脫水過程中的積累[13]。干旱脅迫后，煙草的NCED3基因表達上調(diào)，ABA含量增加[14]。關(guān)于NCED基因在不同脅迫條件下的表達調(diào)控及其作用的研究也有很多報道[15-16]。

研究發(fā)現(xiàn)，越冬前隨著溫度逐漸降低，白菜型冬油菜的葉片逐漸變黃，ABA含量增加[17]，至越冬期葉片完全干枯，次年返青后自生長點重新長出心葉而完成生殖生長(圖1)。因此，本研究克隆了白菜型冬油菜的NCED3基因及啟動子序列，比較其與甘藍型油菜的差異，并分析了不同脅迫處理條件下NCED3的表達特性，為了解NCED3基因的表達調(diào)控和NCED3啟動子的結(jié)構(gòu)特征，培育新的抗逆油菜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用2個抗寒性不同的白菜型冬油菜品種。隴油6號為超強抗寒性品種，可在我國北方極端低溫為-20℃～-32℃的地區(qū)安全越冬，2010―2017年多點平均越冬率為90%；天油2號為強抗寒性品種，可在甘肅天水等地極端低溫為-20℃的地區(qū)種植，2010―2017年多點平均越冬率為60%[1,3]。

選取飽滿的上述油菜種子發(fā)芽，發(fā)芽后將材料播種于10 cm×10 cm的營養(yǎng)缽中，至幼苗生長至5片葉，置于低溫培養(yǎng)箱中，4℃培養(yǎng)10 h后，采集葉片用于RNA的提取。

1.2 基因及啟動子克隆

參照馬驪等[18]方法提取RNA并合成 cDNA 第一鏈。根據(jù)GenBank 中公布的在甘藍型油菜A3染色體上的NCED3 (登陸號：LOC103870025)基因的序列，在白菜型油菜基因組中尋找匹配序列，用匹配序列作模板，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物(引物序列：ATGACTTCTTTCACGGCGACT，TTACACCTGATTCGCCAAGT)克隆基因。

1.3 序列分析

利用 NCBI 網(wǎng)站的軟件BLAST 和 ORF finder進行核苷酸序列比較和開放閱讀框分析。用Expasy Protparam 軟件分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點和氨基酸組成及疏水性。用Conserved Domains分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)使用在線工具 SOPMA 進行預(yù)測，三級結(jié)構(gòu)使用在線軟件Swiss-model 進行模擬。利用BLAST軟件從NCBI的GenBank庫中挑選十字花科植物的NCED3基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，用DNAMAN8軟件進行氨基酸序列多重比較，用MEGA軟件分析基因同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。啟動子預(yù)測采用Plant CARE 及PLACE在線軟件分析。

1.4 基因表達分析

當(dāng)幼苗長至5片葉開始進行脅迫處理，分別為低溫脅迫處理：將幼苗置于低溫培養(yǎng)箱中于4℃培養(yǎng)；干旱脅迫處理：葉面噴施20% PEG-6000模擬干旱；ABA處理：葉面噴施100 μM ABA。于各處理后0(對照，CK)、2、4、8、12 h分別取幼苗相同部位的葉片及根系，液氮凍存后提取RNA用于基因表達分析。根據(jù)上述1.2節(jié)所得基因序列設(shè)計引物BN9DN，以油菜“看家基因”Actin作為內(nèi)參，引物序列見表1。經(jīng)普通PCR擴增后電泳檢測其特異性，以濃度一致的隴油6號和天油2號葉片cDNA為模板，進行熒光定量PCR，目的基因與內(nèi)參基因?qū)?yīng)各3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法計算[18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCED3序列分析

隴油6號NCED3的cDNA序列含有一個長度為1 794 bp的完整ORF，編碼含597個氨基酸的蛋白質(zhì)，屬RPE65超家族，由20種氨基酸組成，其中以Leu、Ala所占比例最高，分別為8.0%、8.2%，相對分子質(zhì)量約65.74 kD，理論等電點為5.81，總平均親水指數(shù)為-0.293，表明該蛋白為親水性蛋白；含有其蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域；具有1處最大疏水峰。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有 27.81% 的α螺旋、23.12% 的延伸鏈、9.72%的β折疊， 39.36%的無規(guī)則卷曲，α螺旋和無規(guī)則卷曲是NCED3二級結(jié)構(gòu)的主要成分(圖2)。

天油2號NCED3的cDNA序列含有一個長度為1,794 bp的完整ORF，編碼含597個氨基酸的蛋白質(zhì)，由20種氨基酸組成，其中以Leu、Ala所占比例最高，均為8.0%，相對分子質(zhì)量約65.78 kD，理論等電點為5.94，總平均親水指數(shù)為-0.318，表明該蛋白為親水性蛋白；含有其蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域；具有1處最大疏水峰。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中含有25.46%的α螺旋、23.62%的延伸鏈、10.55%的β折疊，40.37%的無規(guī)則卷曲，無規(guī)則卷曲是NCED3二級結(jié)構(gòu)的主要成分(圖3)。

表1 PCR引物序列

圖1 越冬前冬油菜葉片變黃(A)，返青后心葉重新長出(B)Fig.1 Winter rapeseed leaves turn yellow (A) and then dry before wintering and grow new leaves (B) next year

圖2 隴油6號NCED3的結(jié)構(gòu)域(A)、疏水性(B)及三級結(jié)構(gòu)模型(C)Fig.2 Analysis of protein domain (A), hydrophobicity (B), and tertiary structure model (C) of NCED3 in Longyou 6

2.2 NCED3序列比對及進化發(fā)育分析

由圖4可見，L6NCED3與BnNCED3蛋白相比，有5處發(fā)生氨基酸變化，相似度為99.16%，與BrNCED3有1處氨基酸不同。T2NCED3與BnNCED3蛋白相比，有6處發(fā)生氨基酸變化，相似度為98.99%，與BrNCED3有6處氨基酸不同。L6NCED3 與 T2NCED3有5處發(fā)生氨基酸變化，相似度為99.16%。對白菜型冬油菜及其他近緣種的NCED3進行同源性比較及系統(tǒng)進化分析(圖5)，隴油6號與白菜的同源性最高，相似度為99.83%，其次為甘藍型油菜、天油2號。隴油6號與天油2號的相似度為99.16%。其中，隴油6號與白菜的相似度最高，天油2號與甘藍型油菜的相似度最高。從進化關(guān)系分析(圖5)，所選的14個種與參試材料可被分為5類。隴油6號、白菜、甘藍型油菜、天油2號及甘藍的NCED3在同一分類中?？梢奛CED3蛋白比較保守，從而也可推斷NCED3在白菜型冬油菜中的功能與甘藍型油菜相似。

2.3 啟動子序列分析

2個品種的啟動子序列相似性為99.38%。啟動子序列預(yù)測結(jié)果顯示，啟動子具有ABRE、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-element等激素響應(yīng)元件(表2)。此外，還鑒定出低溫響應(yīng)元件(LTR)、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件(TC-rich repeat)、生物過程中常見的順式作用元件如CAAT-box等、分生組織表達CAT-box相關(guān)的順式作用元件及- 30 TATA box附近的核心啟動子元件等。可見，NCED3基因?qū)Σ煌姆巧锩{迫有不同的響應(yīng)。2個品種中只有1個不同的元件(circadian)，該元件與晝夜節(jié)律控制有關(guān)。

圖3 天油2號NCED3的結(jié)構(gòu)域(A)、疏水性(B)及三級結(jié)構(gòu)模型(C)Fig.3 Analysis of protein domain (A), hydrophobicity (B), and tertiary structure model (C) of NCED3 in Tianyou 2

表2 啟動子DNA順式作用元件預(yù)測

2.4 NCED3表達分析

由圖6可見，脅迫處理后NCED3在葉片和根中的表達均高于CK，且均呈上升趨勢，于8 h達到峰值后略有下降，說明ABA、低溫和干旱均可誘導(dǎo)NCED3基因表達。ABA處理后(圖6A)，NCED3在2個品種葉片和根中的表達均上調(diào)，其中天油2號的增長幅度高于隴油6號。低溫處理后，基因表達與ABA處理呈現(xiàn)相似的表達趨勢(圖6B)；隴油6號葉片在4 h時的表達水平低于CK，可能是脅迫下的強烈應(yīng)激反應(yīng)所致。PEG處理后，基因表達隨處理時間延長呈逐漸增加的趨勢，于8 h顯著增高后降低(圖6 C)。與根系的表達特性相比，3種處理后葉片的基因表達均在2 h顯著升高，天油2號的升高幅度均大于隴油6號，可推斷天油2號的葉片比隴油6號對脅迫的反應(yīng)更快，脅迫后基因表達快速升高，合成積累大量的ABA來應(yīng)對脅迫。

注：(A) ABA處理后的NCED3基因表達；(B) 低溫(4℃)處理后NCED3基因表達；(C) PEG處理后NCED3基因表達。小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。Note: (A) NCED3 gene expression under ABA treatment; (B) NCED3 gene expression under low temperature (4℃) treatment; (C) NCED3 gene expression under PEG treatment. Different lowercase letters indicate significant differences (P≤0.05).圖6 不同處理條件下NCED3表達分析Fig.6 The effects on NCED3 expression by different treatments

3 討論與結(jié)論

基因結(jié)構(gòu)的改變會導(dǎo)致基因表達的改變，擬南芥中AtNCED3的274和327位氨基酸的變化可能導(dǎo)致其表達的改變[19-20]。在本研究中，隴油6號和白菜的NCED3同源性較高，而天油2號與甘藍型油菜的NCED3同源性較高；2個抗寒性不同的冬油菜NCED3相似度很高，且親緣關(guān)系很近?？梢奛CED3蛋白比較保守，從而也可推斷NCED3在白菜型冬油菜中的功能與甘藍型油菜相似。

基因啟動子中所含的順式作用元件在基因表達調(diào)控中起著重要作用，基因的不同啟動子特征決定了基因的不同表達特征[21-22]。根據(jù)預(yù)測結(jié)果2個品種的啟動子相似性高，具有常見的與激素有關(guān)的元件如：ABRE、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-elemen等，可見NCED3基因的表達可能受到生長素、脫落酸、茉莉酸甲酯等的調(diào)控，本研究結(jié)果也表明ABA處理可誘導(dǎo)NCED3基因的表達。光可以參與植物的光合作用，也是一種非常重要的信號物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[23-24]。本研究的啟動子有3個與光相關(guān)的元件：G-box、TCT-motif和chs-CMA2a，它們通常存在于光誘導(dǎo)基因的啟動子中；由此推斷，NCED3的表達可能會受到光照的調(diào)控。在本研究結(jié)果中，白菜型冬油菜啟動子中有1個特殊的元件，即低溫響應(yīng)元件(low-temperature responsiveness, LTR)，該元件在其他被報道植物的NCED啟動子中不存在[25-28]。因此推測，該基因可能受低溫調(diào)控,本研究的基因表達分析結(jié)果也證實了該推測。本試驗首次分析了低溫(4℃)處理對NCED3表達的影響，低溫可誘導(dǎo)白菜型冬油菜NCED3的表達。2個品種中有1個不同的DNA元件，即晝夜節(jié)律控制元件，它與季節(jié)反應(yīng)的調(diào)節(jié)、從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變以及休眠的開始等相關(guān)[29]。種子萌發(fā)、下胚軸伸長、葉片運動、氣孔導(dǎo)度、開花、衰老等發(fā)育過程均通過晝夜節(jié)律鐘進行調(diào)節(jié)[30]。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，天油2號的下胚軸長度確實比隴油6號的長。因此，如果與晝夜節(jié)律控制因素有關(guān)，這種差異是否與2個品種的抗寒性有關(guān)，可以作為我們今后研究的方向。

本研究中，NCED3基因可以在冬油菜的根和葉中表達，而沒有組織特異性，這與擬南芥的研究結(jié)果相似[31]。經(jīng)過低溫、PEG模擬干旱和ABA處理后，NCED3在隴油6號和天油2號中的表達量均增加。已有研究表明，NCED3通過調(diào)控ABA的合成，在植物耐旱性方面發(fā)揮重要作用[32]。本研究中干旱脅迫可誘導(dǎo)NCED3的表達，12 h前表達量急劇增加，12 h后下降，這與Xian等[32]和Zhang等[11]的研究結(jié)果基本一致。本研究中，在低溫、模擬干旱及噴施ABA處理中，隨著處理時間延長，天油2號的NCED3基因表達增加幅度均高于隴油6號(包括葉片和根)，由此可見，逆境脅迫后弱抗寒品種比強抗寒品種更敏感，脅迫初期快速做出反應(yīng)，調(diào)控基因表達來應(yīng)對逆境，該結(jié)論與Zeng等[33]的結(jié)果相似。