劉艷君，劉文輝，祁 娟，姚 拓，李建宏，李昌寧

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

老芒麥(ElymussibiricusL.)是多年生疏叢型中旱生草本植物，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，產(chǎn)草量高，營養(yǎng)豐富，適口性好、消化率較高，為各類牲畜所喜食[1]。而且老芒麥適應(yīng)性強(qiáng)，易栽培，具有抗寒、抗旱和耐鹽等特性[2]。近年來，該品種在青藏高原東緣生態(tài)恢復(fù)重建、退化沙化草地治理、三江源保護(hù)、退牧還草、種草養(yǎng)畜及人、草、畜三配套等工程建設(shè)中發(fā)揮著骨干草種的作用[3-4]。

研究表明，植物根際含有大量的營養(yǎng)元素和豐富的微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物群落中細(xì)菌是最主要的組成成分，生物學(xué)特性各異，繁殖速度較快[5]，且土壤和細(xì)菌之間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，細(xì)菌可促進(jìn)土壤中有機(jī)殘?bào)w的分解和潛在養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，提高土壤供肥能力，釋放出的CO2可供植物進(jìn)行光合作用。同一作物種植年限越長，受自身和過多施肥等外界條件影響越大，土壤理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生劣變、質(zhì)量下降;且種植年限過長會(huì)引起植物消耗過多養(yǎng)分，不利于保持養(yǎng)分供給平衡，同時(shí)引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，有害真菌的種類和數(shù)量增加，細(xì)菌的種類和數(shù)量減少[6]。目前，國內(nèi)關(guān)于不同種植年限果樹、蔬菜、藥材土壤養(yǎng)分的報(bào)道較多[7-8]，關(guān)于老芒麥的研究則主要集中在種植行距、播種量、施肥方式、雜草防治等方面[9-10]，對于不同種植年限老芒麥根際土壤營養(yǎng)特性和微生物群落多樣性方面的報(bào)道極少，零星報(bào)道表明隨著種植年限的延長，出現(xiàn)老芒麥根系分泌物和鹽分積累、養(yǎng)分失衡、土傳病害加重等一系列問題，形成對老芒麥生長不良的逆環(huán)境[4,11]。因此本研究以高通量測序技術(shù)研究不同種植年限對老芒麥根際土壤細(xì)菌群落多樣性和營養(yǎng)指標(biāo)的影響，采用相關(guān)性分析揭示老芒麥根際土壤細(xì)菌群落(屬水平)和營養(yǎng)指標(biāo)間的相互關(guān)系，以期為老芒麥人工草地科學(xué)管理、根際土壤養(yǎng)分改善和根際微生態(tài)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于祁連山系大通山脈西南麓，青海省海晏縣國家牧草繁育基地，地處36°54′N，100°59′E，海拔3 159 m，是高原大陸型氣候，屬高寒地貌，干濕季分明，雨熱同季，年平均降水量403.6 mm左右，年蒸發(fā)量1 581.75 mm左右，無絕對無霜期[12]。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)材料為不同生長年限的青牧1號老芒麥根際土壤。以種植3 a老芒麥 (Y3)根際土壤為對照組，4 a生老芒麥(Y4) 和7 a生老芒麥(Y7)根際土壤為試驗(yàn)組。試驗(yàn)地選擇坡度、坡向、海拔一致的樣方(10 m×10 m)，按照對角線法選擇長勢一致的蠟熟期老芒麥，將其整株挖出，去除根系周圍附著土壤，抖落離老芒麥根系1 cm 的土壤即為根際土壤[13]。分別采集Y3、Y4和Y7的根際土壤，每個(gè)樣品3次重復(fù)。剔除可見的動(dòng)、植物殘?bào)w和石塊后，將取得的土壤裝入無菌樣品采集袋中，放入采樣箱(-4℃)帶回實(shí)驗(yàn)室。一部分土壤置于室內(nèi)自然風(fēng)干，過1 mm及 0.25 mm篩子后用于理化性質(zhì)測定；另一部分于-80℃保存，用于土壤總DNA 的提取。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤pH值和營養(yǎng)指標(biāo)的測定 土壤理化性質(zhì)的測定方法參考 《土壤農(nóng)化分析》[14]，其中，土壤理化指標(biāo)包括土壤pH、有機(jī)質(zhì)(SOM)、全氮 (TN)、全磷 (TP)、全鉀 (TK)、速效氮 (AN)、速效鉀 (AK)和速效磷 (AP)。

1.3.2 土壤總DNA提取及細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增 土壤總DNA 基因組采用DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，參考試劑盒說明書操作，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。將每個(gè)土樣提取出的3個(gè)DNA樣品充分混合后作為PCR擴(kuò)增模版，采用16S rRNA基因V3～V4 區(qū)域通用引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參照Fadrosh等[15]方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上?？闪γ匪镝t(yī)藥科技有限公司，采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序和分析。

1.3.3 生物信息學(xué)分析 Miseq測序完成后，得到原始的下機(jī)數(shù)據(jù)，利用overlap將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過濾，獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)。對最終獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行97%的相似度聚類，過濾singleton序列，獲得最終的OTU豐度及代表序列，進(jìn)一步進(jìn)行多樣性分析、物種分類組成分析和差異分析等[16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對營養(yǎng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)，表中所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用QIIME軟件計(jì)算Chao1、Shannon 和Simpson指數(shù)，用R軟件繪制稀釋曲線、Venn圖及物種分類柱狀圖。用R軟件中psych包的corr.test函數(shù)計(jì)算細(xì)菌群落和土壤營養(yǎng)指標(biāo)的Spearman相關(guān)系數(shù)值并檢驗(yàn)其顯著性，然后用pheatmap包中的pheatmap函數(shù)進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤營養(yǎng)特征變化規(guī)律

表1表明，老芒麥種植年限對pH的影響表現(xiàn)為隨種植年限的增加而增大，但Y4與Y7間差異不顯著。較Y3而言，全氮、速效氮和速效磷含量隨種植年限的增加均呈顯著降低趨勢(P<0.05)，連續(xù)種植老芒麥4 a和7 a分別可使全氮減少21.9%和34.5%，速效氮減少12.0% 和24.2%，速效磷減少32.0% 和38.9%。有機(jī)質(zhì)、全磷和全鉀含量亦隨種植年限的增加而降低，老芒麥種植第4年SOM、TP和TK較第3年分別減少28.5%、27.3% 和17.8%，但Y4與Y7之間差異均不顯著。速效鉀(AK)含量以Y4的含量最高，Y7最低，說明種植老芒麥第4年時(shí)對AK的含量貢獻(xiàn)最大，種植第7年可使AK的含量減少。

2.2 測序數(shù)據(jù)分析及OTU量

本研究通過高通量測序共得到有效序列41022 條，質(zhì)控過濾后得到36308 條優(yōu)質(zhì)序列，在97%的相似水平下對序列進(jìn)行OTUs聚類，共產(chǎn)生6033 個(gè)OTUs (系列號：PRJNA562109)。OTUs的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量已飽和，能夠準(zhǔn)確反映土壤細(xì)菌群落信息(圖1)。

從圖2可以看出，3個(gè)土壤樣品所共有的OTUs為1149個(gè)，其中Y3、Y4和Y7中所特有的OTUs數(shù)目分別為221、101和152個(gè)，較Y3而言，Y4和Y7的OTUs出現(xiàn)減少的現(xiàn)象，Y4的OTUs最少。

表1 不同種植年限老芒麥的根際土壤營養(yǎng)指標(biāo)

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Sample rarefaction curve

圖2 不同樣地根際土壤細(xì)菌OTUs數(shù)量韋恩圖Fig.2 Wenn diagram of the number of bacterio OTUs inrhizosphere soil from different plots

2.3 細(xì)菌群落多樣性

2.3.1 細(xì)菌群落Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)的變化 Chao1指數(shù)越高表明樣品物種豐富度越高，由圖3(a)可知，Y3、Y4、Y7的Chao 1指數(shù)分別為2 605.42，2 518.46，2 483.89，隨著老芒麥種植年限的增加呈下降趨勢，表明種植年限越長，老芒麥根際土壤細(xì)菌群落的豐富度下降。

Shannon指數(shù)越高表明樣品物種多樣性越高，從圖3(b)可以看出，不同年限老芒麥根際土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)呈現(xiàn)減小的趨勢， Y3、Y4和Y7的Shannon指數(shù)分別為9.79，9.65和9.62(P>0.05)，表明種植老芒麥4 a以后細(xì)菌群落的多樣性趨于不變。

2.3.2 細(xì)菌群落門水平Unifrac 距離的UPGMA聚類分析 通過對Y3、Y4和Y7樣品在門水平上進(jìn)行加權(quán)Unifrac 距離的UPGMA聚類分析(圖4)，結(jié)果顯示Y4與Y3樣地間細(xì)菌組成及豐度相似性基本一致，與Y7樣地間差異較大。

圖3 不同種植年限老芒麥根際土壤細(xì)菌群落Chao 1 (a)和Shannon (b)指數(shù)的變化Fig.3 Changes of Chao 1 (a) and Shannon (b) indices of bacteria community ofrhizosphere soil of Elymus sibiricus in different planting years

圖4 門水平上物種組成UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of bacteria communitycomposition at phylum level

2.4 土壤細(xì)菌群落分布特征

2.4.1 細(xì)菌群落在門水平上的組成 由圖5(a)可見，在門分類水平上，對豐度前20的細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，不同種植年限老芒麥根際土壤細(xì)菌群落以變形菌門 (Proteobacteria)、放線菌門 (Actinobacteria)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)為主。其中變形菌門的豐度以Y7(35.3%)的最高，Y3(31.4%)次之，Y4(28.6%)最低；酸桿菌門以Y4(21.2%)的最高，Y3(17.5%)次之，Y7(17.3%)最低；放線菌門隨種植年限的增加而減少，其豐富度在Y3、Y4和Y7中依次為28.6%、26.8%和26.7%；芽單胞菌門隨種植年限的增加而增加，Y3、Y4和Y7中的豐富度依次為5.9%、6.6% 和8.0%。

2.4.2 細(xì)菌群落在屬水平上的組成 圖5(b)表明，在屬分類水平上，Y3、Y4和Y7中未鑒定的菌屬分別為48.4%、52.9%和47.1%，對Y3、Y4和Y7已鑒定的細(xì)菌群落豐富度在前20的細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群依次為Norank_c_Subgroup_6、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Norank_f_Gemmatimonadaceae、芽球菌屬(Blastococcus)和RB41。其中Norank_c_Subgroup-6在Y3、Y4和Y7的相對豐度分別為9.4%、11.6%和10.2%，Sphingomonas的相對豐度分別為 5.5%、4.8%和5.1%，Norank_f_Gemmatimonadaceae的相對豐度分別為3.7%、4.3%和5.8%，Blastococcus的相對豐度分別為4.2%、3.7%和3.4%。

2.5 細(xì)菌組成與土壤營養(yǎng)指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析表明(圖6)，土壤pH與Bacillus、RB41和Norank_f_67-14呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，與Norank_f_Gemmatimonadaceae、Norank_c_Subgroup_6、Cryobacterium、Ellin6055和Ellin6067呈極顯著負(fù)相關(guān)；SOM與Gaiella和MND1呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，與Norank_o_Rokubac-teriales、Norank_c_KD4-96、Skermanella、Solirubrobacter和Candidatus_Alysiosphaera呈極顯著負(fù)相關(guān)；TN、TP和TK 與Norank_o_Rokubacteriales、Norank_c_KD4-96、Skermanella、Solirubrobacter和Candidatus_Alysiosphaera均呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，與MND1和Gaiella呈極顯著負(fù)相關(guān)；AN與Norank_f_JG30-KF-CM45、鞘氨醇單胞菌屬、Rubrobacter、芽球菌屬和Arthrobacter呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)； AP和AK與Candidatus_Alysiosphaera、Skermanella、Solirubrobacter、Norank_c_KD4-96和Norank_o_Rokubacteriales呈顯著正相關(guān)(P< 0.001)，與MND1和Gaiella呈極顯著負(fù)相關(guān)。

圖5 細(xì)菌群落在門水平(a)和屬水平(b)分布特征分析 Fig.5 Analysis of distribution characteristics about bacterial communities at phylum level (a) and genus level (b)

注: X軸和Y軸分別為環(huán)境因子和物種，通過計(jì)算獲得相關(guān)性R值和P值。R值在圖中以不同顏色表示，若P<0.05則用 * 標(biāo)出，右側(cè)圖例是不同R值的顏色區(qū)間； * 表示0.01

3 討論與結(jié)論

3.1 不同種植年限老芒麥根際土壤肥力特性

作物的連續(xù)種植會(huì)向土壤釋放一系列的次生代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物的積累會(huì)引起土壤營養(yǎng)指標(biāo)的惡化并且產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)老芒麥人工草地4 a以后，隨著年限的逐漸延長，土壤根際的全氮、速效氮、速效磷的含量逐漸減少。有研究發(fā)現(xiàn)茶樹連續(xù)種植4 a后可使土壤的全氮、速效磷含量及脲酶的活性下降，致使土壤營養(yǎng)元素缺乏和循環(huán)能力降低[7]，并且植物的生產(chǎn)力也會(huì)受到抑制[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，pH隨種植年限的增加而增大，這一結(jié)論與研究不同種植年限對設(shè)施蔬菜土壤pH逐年酸化的結(jié)論相反[19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)老芒麥根際土壤有機(jī)質(zhì)、全磷和全鉀含量也隨種植年限的增加而降低，但Y4與Y7均差異不顯著。這說明不同種植年限的老芒麥根際土壤的有機(jī)質(zhì)、全磷和全鉀呈現(xiàn)先減少后保持穩(wěn)定的趨勢，究其原因可能是老芒麥人工草地建植的前3年適應(yīng)能力強(qiáng)，草地的物種組成單一，微生物主要在老芒麥根際進(jìn)行繁殖及代謝活動(dòng)，促進(jìn)了土壤有機(jī)質(zhì)的大量分解，全磷被溶磷微生物所分解，致使全磷的含量減少[7,16]，這一研究結(jié)論通過相關(guān)性分析也得到了證實(shí)(圖6)，如Norank_o_Rokubacteriales、Norank_c_KD4-96、Skermanella、Solirubrobacter和Candidatus_Alysiosphaera均與全磷呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，而MND1和Gaiella與全磷呈極顯著負(fù)相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)隨著人工草地種植年限的增加，會(huì)有大量的雜草不斷生長，草地發(fā)生演替，植物的豐富度和多樣性會(huì)逐年升高，植物根際的有機(jī)質(zhì)和全磷被其他的雜草生命活動(dòng)所利用[20]。

3.2 不同種植年限老芒麥根際土壤細(xì)菌群落多樣性

Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別表示樣品中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，Chao 1值越高表明細(xì)菌群落的豐富度越高，Shannon指數(shù)越高表明微生物群落的多樣性越高[21]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Y3、Y4和Y7的Chao1指數(shù)呈不斷下降趨勢，表明隨種植年限增長，老芒麥根際土壤細(xì)菌群落的豐富度下降越明顯。Shannon指數(shù)的變化趨勢與Chao 1相一致。邵穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)微生物群落的組成和多樣性主要與其所處的生境有關(guān)，種植年限增加，植物根際分泌的次生代謝物降低了根際生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性，使得根際微生物的數(shù)量減少。

本研究發(fā)現(xiàn)在門水平上變形菌門和放線菌門的相對豐度均較高且含量大于18%，并且放線菌門的豐度在Y3、Y4和Y7中依次減少，表明老芒麥種植年限的增加不利于放線菌門細(xì)菌群落的繁殖，究其原因主要是放線菌門參與土壤中有機(jī)質(zhì)的代謝活動(dòng)，能將有機(jī)質(zhì)分解為碳源[22]，這也與本研究中隨著老芒麥種植年限的增加有機(jī)質(zhì)含量減少的結(jié)論相似。變形菌門和酸桿菌門由于其不同的生活方式，常被用作衡量土壤營養(yǎng)狀況的指標(biāo)[21]，酸桿菌門的相對豐度能夠表明土壤的酸性條件[23]。芽單胞菌門的豐度在Y3、Y4和Y7中依次增大，因?yàn)檠繂伟T有很強(qiáng)的脫氮功能，其相對豐度隨著氮素水平的增加而降低[24]，而本研究中隨著老芒麥種植年限的增加,全氮及速效氮的含量均減小。

在屬水平上，細(xì)菌群落芽球菌屬的豐富度隨著老芒麥種植年限的增加呈減少趨勢，表明老芒麥種植年限會(huì)影響芽球菌屬的相對豐富度，不利于芽球菌屬細(xì)菌群落的繁殖，通常芽球菌屬可適應(yīng)干旱、酸性、重金屬、抵抗輻射和厭氧等極端環(huán)境，可產(chǎn)生孢子，但不容易分離培養(yǎng)，其抗逆境的特性可在環(huán)境修復(fù)、沙漠治理等方面應(yīng)用[25-26]。鞘氨醇單胞菌屬在Y3、Y4和Y7中的細(xì)菌群落豐富度以Y4最低，Y7次之，Y3的豐富度最高，此結(jié)果表明，較Y3而言，鞘氨醇單胞菌屬的豐富度以第4年下降最快，已有研究表明鞘氨醇單胞菌屬的群落在其生命活動(dòng)中可分泌過氧化氫酶，而過氧化氫酶可分解植物根系分泌的有毒性物質(zhì)，通常起到解毒作用，被視為植物益生菌[27]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在老芒麥根際細(xì)菌群落未鑒定菌屬豐富度在Y3、Y4和Y7中分別為48.4%、52.9%和47.1%，表明在老芒麥種植的樣地中依然存在大量的未挖掘利用的微生物資源。