張愛霞，朱慶鋒，陳 沛，于 洋，魏文康，晏石娟，劉文華

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東 廣州 510640）

核酸檢測技術(shù)在傳染病病原檢測、食品安全檢疫和環(huán)境生態(tài)監(jiān)測等方面發(fā)揮重要作用?？焖俸怂釞z測對于診斷和監(jiān)測感染性病原體并提供最新的疾病信息以控制傳播和及時治療必不可少，即時檢測（Point-of-care testing，POCT）有助于提高效率，及時優(yōu)化決策，降低成本，尤其對資源受限的地區(qū)更為重要。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)，理想的病原體診斷檢測應(yīng)是廉價、靈敏、特異、易用、快速、無需大型設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)［1］。目前常用的核酸檢測技術(shù)主要有聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、基因芯片、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和基因測序技術(shù)，但這些技術(shù)存在操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴或靈敏度低等局限［1-2］。因此，迫切需要開發(fā)更為簡便快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)的新一代核酸檢測技術(shù)。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)基因（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated gene，CRISPR/Cas）系統(tǒng)是存在于細(xì)菌和古菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能在單鏈向?qū)NA（Single guide RNA，sgRNA）指引下將Cas核酸酶與靶序列相結(jié)合并對其進(jìn)行切割［3］。該系統(tǒng)中的CRISPR/Cas13是目前CRISPR/Cas家族中唯一只靶向單鏈RNA（Single-stranded RNA，ssRNA）的系統(tǒng)，自2016年6月報道［4］以來，CRISPR/Cas13系統(tǒng)就備受全球研究人員的關(guān)注和重視，這不僅因?yàn)樗且环N只靶向RNA的新型CRISPR系統(tǒng)，更重要的是其具有特異性切割和“附帶切割”能力。高的靶向效率和優(yōu)異的酶切能力使CRISPR/Cas13系統(tǒng)在核酸檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了基于CRISPR/Cas13的核酸檢測系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀，以期為相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供參考。

1 CRISPR/Cas13在CRISPR系統(tǒng)中的類別歸屬及其亞型

目前已知的CRISPR/Cas系統(tǒng)有6型和30多種亞型［5］，根據(jù)Cas的蛋白組成及發(fā)揮作用的方式，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為1類系統(tǒng)（Class 1）和2類系統(tǒng)（Class 2）兩大類群。Class 1的Cas是一種多酶復(fù)合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；Class 2則僅含單個多結(jié)構(gòu)域的Cas蛋白［6］，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型［7-8］。Cas13屬于2類CRISPR/Cas系統(tǒng)的Ⅵ型，包含單一的效應(yīng)蛋白質(zhì)Cas13，CRISPR/Cas13系統(tǒng)類似于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，但Cas9靶向的是DNA，而Cas13僅靶向切割ssRNA［4］。

CRISPR/Cas13系統(tǒng)根據(jù)Cas蛋白的系統(tǒng)發(fā)育可分為 4 種亞型［6］（圖1），即VI-A、VI-B（VIB1、VI-B2）、VI-C和VI-D［9-10］，這4個亞型同源性不高，同源序列僅限于Cas13上的高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合域（Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN）位點(diǎn)。VI-A 亞型具有Cas1和Cas2，其Cas13蛋白稱為Cas13a，目前科學(xué)家已經(jīng)從Leptotrichia buccalis、Leptotrichia wadei、Leptotrichia shahii和Lachnospiraceae bacterium等多種細(xì)菌中解析出了Cas13a結(jié)構(gòu)，根據(jù)其來源不同分別稱為LbuCas13a［11］、LwaCas13a［12］、LshCas13a［13］和LbaCas13a［14］。VI-B亞型缺少Cas1和Cas2，具有Csx28和Csx27，Csx28能增強(qiáng)Cas13b活性，Csx27對其有抑制作用，從而進(jìn)一步分成VI-B1 和VIB2［15］。絕大多數(shù)VI-D亞型都有相關(guān)的含WYL結(jié)構(gòu)域的輔助蛋白，這個結(jié)構(gòu)域通常與原核防御系統(tǒng)有關(guān)［16］。VI-D亞型的Cas13d比較小，平均長度比Cas13a和Cas13c短190～300個氨基酸序列，這為RNA的調(diào)控和檢測提供了便利［16］。對于VI-C亞型，目前相關(guān)研究較少［6］。

圖1 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的4 種亞型［6］Fig. 1 Four subtypes of CRISPR/Cas13 system［6］

2 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的組分特征及其分子作用機(jī)制

2.1 Cas13蛋白

2017年，中國科學(xué)院生物物理研究所解析了LbuCas13a與CRISPR RNA（crRNA）二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)和LbuCas13a蛋白的晶體結(jié)構(gòu)［13］。LbuCas13a具有“雙瓣葉”球狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由1個 crRNA識 別 瓣 葉（Recognition lobe，REC）和1個核酸酶瓣葉（Nuclease lobe，NUC）組成。REC葉片包含NTD（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結(jié)構(gòu)域，NUC葉片包含兩個HEPN結(jié)構(gòu)域、Helical-2結(jié)構(gòu)域以及連接兩個HEPN結(jié)構(gòu)域的連接結(jié)構(gòu)域［13］（圖2）。負(fù)責(zé)切割crRNA前體和靶RNA的活性位點(diǎn)分別位于Helical-1和HEPN結(jié)構(gòu)域。HEPN催化切割位點(diǎn)位于Cas13a蛋白的外表面，Cas13a蛋白一旦被靶RNA活化，即可行使非特異性RNA酶功能，裂解附近的其他ssRNA［11］。

圖2 Cas13a與crRNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)及其催化活性中心［13］Fig. 2 Crystal structure of Cas13a in complex with crRNA and its catalytic active sites［13］

HEPN催化切割位點(diǎn)中存在一些高度保守的氨基酸殘基，對靶RNA的切割起主要作用，分別是HEPN1結(jié)構(gòu)域中第597位精氨酸（Arg597）、第602位組氨酸（His602）和HEPN2結(jié)構(gòu)域中第1 278位精氨酸（Arg1278）、第1 283位組氨酸（His1283）?；罨腍EPN催化切割位點(diǎn)形成1個含R-X4-6-H 基序的“X”形三維空間結(jié)構(gòu)，上述4個關(guān)鍵氨基酸殘基位于外表面，從而對RNA酶切發(fā)揮關(guān)鍵作用［13,17］（圖 2）。此外，HEPN1結(jié)構(gòu)域中第598位天冬酰胺（Asn598）和HEPN2結(jié)構(gòu)域中第1 279位天冬酰胺（Asn1279），對Cas13a的酶切活性也起著重要作用［13,17］。Cas13b和Cas13d也包含2個HEPN結(jié)構(gòu)域，有類似 Cas13a的功能［18-19］。

2.2 crRNA

圖3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)4種亞型的crRNA結(jié)構(gòu)［6］Fig. 3 crRNA structure of four subtypes of CRISPR/Cas13 system［6］

crRNA是CRISPR/Cas13系統(tǒng)的另一個重要組成元件，由2個區(qū)域組成，即重復(fù)區(qū)域和引導(dǎo)區(qū)域（間隔區(qū)域）。CRISPR/Cas13系統(tǒng)4個亞型的crRNA 結(jié)構(gòu)略有不同［6］（圖3）。CRISPR/Cas13a中的crRNA［19］的重復(fù)區(qū)域有31個堿基，位于5'端，其二級結(jié)構(gòu)是 1個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包含1個由5個堿基配對形成的莖（莖上有2個堿基AC或AA的凸起）、1個由7～9個堿基形成的環(huán)，以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩端的鄰近基序。重復(fù)區(qū)域能在Cas13a酶切靶RNA時保護(hù)自身不被切割，而且在促進(jìn)crRNA與Cas13a緊密結(jié)合方面起關(guān)鍵作用。引導(dǎo)區(qū)域有28個堿基，位于3'端，其序列可與靶RNA序列互補(bǔ)形成1個28 bp形似A-DNA螺旋的引導(dǎo)-靶RNA二聚體。在CRISPR/Cas13b系統(tǒng)中，crRNA前體被加工成一個66 nt 的成熟crRNA，含36 nt的重復(fù)區(qū)域和30 nt的引導(dǎo)區(qū)域［15］。二級結(jié)構(gòu)分析顯示，與其他3個亞型相比，其crRNA具有更長的重復(fù)序列莖（9～14 bp），莖上具有幾個不成對的區(qū)域和凸起，莖環(huán)更小［20］。在CRISPR/Cas13d 系統(tǒng)中，crRNA具有36 nt的重復(fù)區(qū)域，包含 8～10 nt的莖和 4～6 nt的 環(huán)，1個末端含AAAAC基序的3'端側(cè)翼單鏈區(qū)［9,16］。

2.3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的分子作用機(jī)制

2.3.1 CRISPR/Cas13系統(tǒng)在體內(nèi)的防御分子機(jī)制CRISPR/Cas13系統(tǒng)在體內(nèi)的防御分子機(jī)制主要體現(xiàn)在4個階段（圖4）：（1）外源核酸序列的獲取［21］。獲取外源核酸序列（如噬菌體和質(zhì)粒）并整合在 CRISPR 陣列的“間隔”序列中形成新的間隔，研究認(rèn)為Cas1、Cas2是新間隔形成的主要功能蛋白［22］。（2）crRNA 的表達(dá)與加工［14］。pre-crRNA是CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄表達(dá)的初產(chǎn)物，而Cas13具有處理自身pre-crRNA為成熟crRNA的RNase活性［9,17］，pre-crRNA與Cas13蛋白結(jié)合，引起Cas13蛋白構(gòu)象變化而形成一個酸堿催化中心，催化酶切pre-crRNA形成成熟的crRNA［23-24］。（3）HEPN-RNase活性激活。靶ssRNA與Cas13-crRNA復(fù)合物結(jié)合，并與crRNA堿基互補(bǔ)配對，從而使Cas13蛋白發(fā)生協(xié)同構(gòu)象變化，在HEPN結(jié)構(gòu)域形成催化反應(yīng)中心，激活了Cas13蛋白的HEPNRNase的酶切活性。（4）酶切反應(yīng)階段。激活的Cas13蛋白能特異性切割靶ssRNA，還具有“附帶切割”的RNase活性，導(dǎo)致原核細(xì)胞中其他ssRNA被降解［4,11］。

圖4 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的防御分子作用過程［6］Fig. 4 Molecular interaction process of CRISPR/Cas13 system［6］

2.3.2 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的靶向特異性分子機(jī)制 激活的Cas13蛋白能特異性切割靶ssRNA，其靶向特異性主要由以下3個因素決定（圖5）：（1）crRNA和靶RNA之間堿基的準(zhǔn)確配對。Cas13-crRNA復(fù)合物在與靶RNA結(jié)合之前處于無活性狀態(tài)，只有靶RNA與crRNA互補(bǔ)配對形成穩(wěn)定結(jié)合從而誘發(fā)Cas13的協(xié)同構(gòu)象變化，才能激活Cas13的酶切活性，導(dǎo)致Cas13對靶RNA的高度靶向特異性［13,24］。而非配對 ssRNA無法穩(wěn)定地與Cas13-crRNA復(fù)合物相結(jié)合，不能激活Cas13的酶切活性。（2）crRNA與靶RNA形成的二聚體中，有個對錯配十分敏感的區(qū)域，如果此處發(fā)生錯配則Cas13a不能切割靶RNA［6,11］。（3）前間隔序列側(cè)翼位點(diǎn)（Protospacer-flanking site，PFS），其作用如同CRISPR/ Cas9系統(tǒng)靶位點(diǎn)側(cè)翼的原間隔子相鄰基序（Protospacer adjacent motif，PAM）［25-26］。研究發(fā)現(xiàn)，LshCas13a的PFS為protospacer-3' 側(cè)翼的A、U或C（H）而不是G［2］。如果為G，則會顯著降低 HEPN 核酸酶的活性［27］。Gootenberg等［28］通過體外裂解試驗(yàn)，證明LwaCas13a具有輕微的“H”PFS偏好，但對細(xì)菌篩選［12］或人類細(xì)胞系質(zhì)粒文庫篩選［20］PFS時，沒有檢測到LwaCas13a的PFS偏好。不同來源的Cas13b的PFS也有差別，利用來自Bergeyella zoohelcum和Prevotella buccae的Cas13b在細(xì)菌中進(jìn)行靶標(biāo)文庫篩選時，PFS為5'和3'端的雙向PFS，其中5'端的一般為D（A/U/G），3'端的一般為NAN或NNA［15］，但對PspCas13b進(jìn)行細(xì)菌中錯配的目標(biāo)文庫實(shí)驗(yàn)時，則不需要PFS［20］。對于Cas13d，使用細(xì)菌篩選策略均未檢測到PFS序列。

圖5 CRISPR/Cas13系統(tǒng)的靶向特異性分子機(jī)制［6］Fig. 5 Molecular mechanism of the target specificity of CRISPR/Cas13 system［6］

3 基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的特異性高靈敏度酶報告解鎖技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展

2016年，East-Seletsky等［17］通過引入 RNA熒光報告分子，開發(fā)出基于CRISPR/Cas13a檢測不同靶RNA的新方法。RNA熒光報告分子上連接熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，激活的Cas13a除了進(jìn)行靶RNA特異性切割外還“附帶切割”RNA熒光報告分子，隨著熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的連接RNA鏈斷裂而發(fā)出熒光，而通過檢測熒光信號即可進(jìn)行特定核酸檢測。該研究顯示，檢測1～10 pmol /L的靶RNA可在30 min內(nèi)產(chǎn)生十分明顯的核酸降解信號，但pmol /L級別的檢測靈敏度不能滿足臨床檢測需求，因此僅引入RNA熒光報告分子仍不夠，還需要更多的設(shè)計(jì)策略來提高檢測的靈敏度。

2017年，張峰研究團(tuán)隊(duì)［28］設(shè)計(jì)研發(fā)出基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的特異性高靈敏度酶報告解鎖（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）技術(shù)（圖6）。該技術(shù)除了加入RNA熒光報告分子，還進(jìn)行了重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA），即對靶DNA或RNA進(jìn)行RPA或RT-RPA擴(kuò)增，擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物用T7核糖核酸聚合酶轉(zhuǎn)錄為RNA，然后在crRNA引導(dǎo)下激活Cas13a， 激活的Cas13a切割RNA熒光報告分子從而能檢測到熒光信號。SHERLOCK技術(shù)能夠檢測到amol /L級（10-18mol/L）濃度的RNA或DNA，實(shí)現(xiàn)了單分子靈敏度和單堿基特異性檢測。而且SHERLOCK所用檢測試劑可凍干制備成濾紙片，成本低廉，使用方便，非常適用于即時檢測。研究發(fā)現(xiàn)，SHERLOCK具有多種功能：（1）短時間內(nèi)檢測患者血液或尿液樣本中Zika病毒的存在并區(qū)分非洲和美國Zika病毒株的基因序列；（2）識別特定的細(xì)菌類型，如大腸桿菌；（3）檢測抗生素耐藥性基因；（4）在模擬的游離DNA中識別癌癥突變；（5）識別人基因組上的SNP。雖然SHERLOCK具有高靈敏度和高特異性，但檢測通量低且不能定量。為了進(jìn)一步提升SHERLOCK的性能，2018 年張峰研究團(tuán)隊(duì)［29］對SHERLOCK技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化升級，稱之為第二代SHERLOCK（SHERLOCKv2）。第一代SHERLOCK只能每次檢測一種核酸序列，但SHERLOCKv2一次分析可同時提供多達(dá)4種不同目標(biāo)的熒光信號，可同時測試多個目標(biāo)。除了檢測目標(biāo)數(shù)量的升級外，SHERLOCKv2也使用了額外的CRISPR相關(guān)酶（Csm6）來放大其檢測信號，從而使得靈敏度提高了100倍。SHERLOCKv2還能夠進(jìn)行定量測定，檢測限可低至2 amol/L。SHERLOCKv2有效解決了第一代SHERLOCK檢測通量低、不能定量的問題，而且檢測時使用了側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測，使檢測更加便捷。雖然SHERLOCK技術(shù)使檢測擺脫了設(shè)備及人員的局制，但檢測樣本遺傳物質(zhì)提取成為即時檢測的限制因素，同年，張鋒研究團(tuán)隊(duì)［30］研發(fā)了一種加熱未提取診斷樣品以消除核酸酶（Heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases，HUDSON）的方法，該方法僅需對臨床樣本進(jìn)行核酸酶滅活和加熱等快速處理，即可進(jìn)行SHERLOCK反應(yīng)，而且2 h內(nèi)便可肉眼觀測結(jié)果，如在全血、血清和唾液的病毒檢測中，以極高的靈敏度（1 copy/μL） 檢測并區(qū)分出4種DENV血清型以及地區(qū)性ZIKV毒株。

圖6 基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK核酸檢測示意圖［25］Fig. 6 Schematic diagram of SHERLOCK nucleic acid detection based on CRISPR/Cas13［25］

4 CRISPR/Cas13系統(tǒng)在核酸檢測中的應(yīng)用

CRISPR/Cas13系統(tǒng)能特異切割靶ssRNA，且具有非特異性的“附帶切割”能力［4］，這些優(yōu)良特性以及SHERLOCK技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展為CRISPR/Cas13系統(tǒng)在核酸檢測領(lǐng)域的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐和設(shè)計(jì)思路。

4.1 CRISPR/Cas13系統(tǒng)在病原體檢測中的應(yīng)用

Chang等［31］利用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)在37℃下成功檢測了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），檢測限為172 copies/μL，而且與豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒無交叉反應(yīng)。Liu等［32］以H7N9的HA基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性crRNA，與RT-RPA和T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)結(jié)合，成功建立了基于CRISPR/Cas13a的H7N9快速檢測方法。此外，CRISPR/Cas13系統(tǒng)也成功用于EB病毒［33］、埃博拉病毒［34］等的準(zhǔn)確、快速檢測。最近的新型冠狀病毒SARS-CoV-2疫情給全人類的健康帶來了巨大沖擊。張峰［35］使用合成的2019-nCoV RNA片段，設(shè)計(jì)并測試了兩種crRNA，每種crRNA均能特異性識別2019-nCoV的一種特征性核酸片段，通過基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)，可以檢測出僅10～100 copies/μL的病毒。2020年2月，張峰研究團(tuán)隊(duì)［36］向全球公布了該技術(shù)的詳細(xì)操作流程，為方便快速準(zhǔn)確地檢測新型冠狀病毒感染者提供了有力的技術(shù)支撐。Patchsung等［37］使用SHERLOCK技術(shù)對154個鼻咽和咽喉拭子樣本的SARS-CoV-2進(jìn)行檢測，在每個反應(yīng)42個RNA拷貝的檢測限內(nèi)，熒光讀數(shù)法100%特異和100%敏感，而用側(cè)流層析法是為100%特異和97%敏感。為了能同時測試多個病原體，Ackerman等［38］開發(fā)了可同時測試多個樣本的核酸多元評價組合陣列反應(yīng)（Combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids，CARMEN），CARMEN和Cas13檢測結(jié)合（CARMEN-Cas13）使用，可以在單個陣列上對4 500多個crRNA目標(biāo)進(jìn)行可靠的測試，并且實(shí)現(xiàn)了對甲型流感病毒的全面分型。

CRISPR/Cas13系統(tǒng)不僅成功應(yīng)用于病毒檢測，還可檢測食品和臨床樣本中少量病原菌。Shen等［39］將核酸變構(gòu)探針和CRISPR/Cas13a組合，研發(fā)了APC-Cas檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)能特異靈敏地定量檢測牛奶等各類樣品中的腸炎沙門氏菌細(xì)胞，而且還可以識別小鼠血清中低數(shù)量的腸炎沙門氏菌細(xì)胞，將早期和晚期感染的小鼠與未感染的小鼠區(qū)分開。Zhou等［40］開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas13a的細(xì)菌檢測（CRISPR/Cas13a-based bacteric detection，CCB）方法，能夠特異檢測到低至100 amol/L的金黃色葡萄球菌基因組DNA，其性能與傳統(tǒng)的培養(yǎng)計(jì)數(shù)法相當(dāng)，但檢測時間短且靈敏度高。

4.2 CRISPR/Cas13系統(tǒng)在耐藥突變檢測中的應(yīng)用

除了病原體的檢測，CRISPR/Cas13系統(tǒng)在耐藥突變檢測方面也發(fā)揮了重要作用。Wang等［41］建立了一種基于PCR的CRISPR/Cas13a檢測系統(tǒng)（PCR-CRISPR），可用于乙型肝炎病毒（HBV）及其YMDD（酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸）耐藥突變的檢測，每次可檢測到1個拷貝，對臨床上低水平的HBV DNA和耐藥突變的檢測具有重要價值。此外，Ackerman等［38］通過CARMEN結(jié)合Cas13檢測實(shí)現(xiàn)了對數(shù)十種HIV耐藥突變的多重鑒定。

4.3 CRISPR/Cas13系統(tǒng)在物種識別和轉(zhuǎn)基因鑒定中的應(yīng)用

準(zhǔn)確的物種識別是生態(tài)學(xué)研究和監(jiān)測基本的方面，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必須明確的重要部分。Baerwald等［42］使用基于 CRISPR/Cas13的 SHERLOCK 技術(shù)，成功鑒定了3種現(xiàn)場極易被誤認(rèn)的魚類物種，充分證明SHERLOCK技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高度精確的物種分類鑒定。轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的有效識別是農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)業(yè)鏈條全過程監(jiān)管的有效保障。張峰研究團(tuán)隊(duì)［43］成功利用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)在30 min內(nèi)即可檢測出轉(zhuǎn)基因大豆中的抗草甘膦基因，并能對大豆混合物中抗草甘膦基因的水平進(jìn)行量化。

4.4 基于CRISPR/Cas13的核酸檢測技術(shù)存在的問題

相對于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，基于CRISPR/Cas13的核酸檢測技術(shù)具有更高的靈敏度，更好的特異性，而且無需昂貴設(shè)備和專業(yè)操作人員，方便快捷，成本低廉，因此成為生物檢測領(lǐng)域的耀眼新星［1,44-45］。然而，目前所使用的基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)還存在一些不足，主要體現(xiàn)在以下方面：（1）基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)一般需使用RNA熒光報告探針，但RNA容易降解，致使可能出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果；（2）DNA或RNA的有效獲取是核酸檢測的基礎(chǔ)，簡便快捷無需依靠儀器即可有效獲取DNA或RNA，是CRISPR/Cas13核酸檢測技術(shù)能在即時檢測中應(yīng)用的保障，因此，需要進(jìn)一步開發(fā)特別是針對植物或動物組織DNA或RNA 的簡便獲取技術(shù)；（3）由于單獨(dú)使用Cas13檢測的靈敏度偏低，基于CRISPR/Cas13的核酸檢測技術(shù)一般需要兩個反應(yīng)步驟，第一個步驟是擴(kuò)增反應(yīng)，第二個步驟是將擴(kuò)增的樣本加入到包含Cas13蛋白和其他反應(yīng)試劑的試管中進(jìn)行檢測反應(yīng)，這不但增加了檢測流程的復(fù)雜性，而且樣本在轉(zhuǎn)移步驟可能被污染。因此，需要進(jìn)一步開發(fā)更為簡便的檢測手段，讓擴(kuò)增RNA或DNA的步驟和Cas13蛋白檢測的化學(xué)反應(yīng)能夠在同一個試管中進(jìn)行，或挖掘更多新型Cas并建立更為簡單高效的無需擴(kuò)增的CRISPR/Cas檢測方法。

5 展望

基于CRISPR/Cas13系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)的靈敏性和特異性非常突出，已經(jīng)達(dá)到amol/L甚至zmol/L的范圍，并能檢測點(diǎn)突變［29］，這必將在核酸檢測領(lǐng)域發(fā)揮舉足輕重的作用。對于檢測速度，最快的分析（如SHERLOCKv2）至少需要15 min［29］，以后可以通過鑒定新的Cas蛋白和工程改造已存在的Cas蛋白，以及優(yōu)化信號放大系統(tǒng)，以進(jìn)一步提高檢測速度?；贑RISPR/Cas13系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)使用了無需核酸提取的病原體檢測（HUDSON）［30］、等溫?cái)U(kuò)增以及試紙條檢測，為了檢測更加便捷，今后應(yīng)發(fā)展一步診斷法，包括病原體核酸釋放、預(yù)擴(kuò)增、CRISPR-Cas誘導(dǎo)反應(yīng)和信號讀出等。未來還可以將人工智能（Artifificial intelligence，AI） 與 CRISPR-Cas13診斷測試相結(jié)合，構(gòu)建一個快速、準(zhǔn)確和更智能的感染性病原體診斷預(yù)警系統(tǒng)。

隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)在細(xì)菌、古菌和細(xì)菌大病毒中的不斷發(fā)現(xiàn)，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)得以不斷豐富發(fā)展。如CRISPR基因編輯先驅(qū)蛋白Cas9，失去切割活性的變體dCas9也可被固定在石墨烯納米材料上，成為核酸檢測芯片［46］。Cas phi是新近發(fā)現(xiàn)的具有功能的最小分子量的Cas12類蛋白，識別和切割dsDNA被激活后，同樣具有ssDNA附帶切割活性［47］。因此以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)，必將彌補(bǔ)以PCR為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)核酸檢測技術(shù)的不足，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。