舒丹陽,熊 犍,劉鵬展,崔 春

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一個全球公共衛(wèi)生問題,患病人數(shù)一直在上升,預測到2045年,約有6.93億糖尿病患者[1]。DM作為一種慢性代謝性疾病以各種方式影響身體健康,身體器官(如腎臟、心臟、眼睛、血管和神經(jīng))的損傷、功能障礙和衰竭。高血糖引起的血管并發(fā)癥造成代謝紊亂、氧化應激增加、腎多醇形成、蛋白激酶活化和晚期糖基化終產(chǎn)物的積累和腎小球的損傷[2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是指糖尿病發(fā)展過程中引起的腎臟功能紊亂,是一種微血管并發(fā)癥,并最終導致終末期腎病。DN的典型癥狀是細胞外基質(zhì)增加導致基底膜增厚,腎小球系膜和腎小管間質(zhì)增大,腎小球濾過率降低,玻璃體病變和壞死,足細胞丟失,尿微量白蛋白增加。糖尿病腎病患者的死亡率比無腎病糖尿病患者高約30倍[3]。因此,DN的防治日益受到重視。

沙棘(HippohaerhamnoidesL.)是一種天然的藥食同源性植物,含有的沙棘多糖、原花青素以及酚酸類物質(zhì)均具有顯著的降血糖的活性[4-5]。近年來,越來越多的文獻報道了沙棘籽蛋白的降血糖活性。沙棘籽蛋白能夠顯著降低STZ誘導的糖尿病小鼠的血糖,提高脂肪酸代謝、降血脂、增加腸道益生菌[6],改善糖尿病引起的細胞炎癥因子的表達[7]。劉洪霞等[8]也驗證了沙棘籽蛋白對于db/db瘦素缺陷型糖尿病小鼠同樣具備顯著的降血糖活性。但是蛋白質(zhì)由于分子量較大,導致功能性較差,降低了其生物利用率。而酶解蛋白質(zhì)一般可以收獲分子量較小和功能性較好的活性多肽[9-12]。例如,袁曉晴等[13]發(fā)現(xiàn)了癩葡萄酶解多肽具有顯著的降血糖活性,而癩葡萄蛋白沒有這種生物活性。

目前已有文獻報道沙棘籽蛋白的降血糖活性,沙棘籽蛋白肽(SSPE)的降血糖研究尚未見報道。因此,本研究使用酶解后的沙棘籽蛋白多肽灌胃db/db糖尿病小鼠,通過測定體重、血糖值、臟器指數(shù)、肌酐、尿酸、尿素氮和尿蛋白以及腎臟病理切片等指標來探究對糖尿病小鼠的降血糖效果和腎臟保護作用,以期為多肽類的糖尿病藥物開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12只雄性SPF級m/m正常小鼠(5周齡)和60只雄性SPF級db/db糖尿病模型小鼠(5周齡) 購于常州卡文斯實驗動物有限公司,動物許可證編號:2018D046;沙棘籽蛋白肽 實驗室自制;鹽酸二甲雙胍 0.25 g/片,廣州白云山天心制藥股份有限公司;胰酶 10000 U/g,諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;乙醚(分析純) 廣州芊薈化玻儀器有限公司;96%牛血清蛋白 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;4%多聚甲醛 廣州市化學試劑廠;無水乙醇 廣州芊薈化玻儀器有限公司。

ACCU-CHEK Active活力血糖儀 羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;丙二醛、尿素氮、肌酐、尿酸酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;RT-6500型酶標分析儀 上海沛歐分析儀器有限公司;eclipse-e100型光片顯微鏡 日本尼康公司;AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多國際股份有限公司;BJ-500A型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;GL-21M型高速冷凍離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司;THZ-82型恒溫振蕩器常州國華電器有限公司;雷磁PHS-3EpH計 上海儀電科學儀器有限公司;152VM4H01C型超低溫醫(yī)用冰箱 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SCIENTZ-18N型冷凍干燥機 東莞布魯斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沙棘籽蛋白肽的制備 采用此前的沙棘籽蛋白制備工藝[15],取備用的凍干蛋白(蛋白含量80%±2%)采用胰酶進行酶解,加酶量0.35%,溫度45 ℃酶解6 h,8000 r/min離心15 min取上清液,凍干得到回收率75.38%、水解度13.55%的沙棘籽蛋白肽。

1.2.2 實驗小鼠的分組及灌胃處理 對小鼠進行耳號標記,共有6組小鼠,每組12只,進行灌胃實驗,灌胃時間為8周,給與普通飼料,飲用水為無菌純凈水,每次灌胃量均為0.5 mL。

m/m小鼠為正常對照組(NC),每日灌胃等量生理鹽水。db/db糖尿病模型小鼠在適應性飼養(yǎng)7 d后測了初始血糖,與正常m/m小鼠相比,均為糖尿病小鼠,符合實驗要求。將db/db小鼠隨機分為5組:空白對照組(BC),每日灌胃等量生理鹽水;陽性藥物對照組(PC),每日灌胃300 mg/kg鹽酸二甲雙胍懸浮液;沙棘籽蛋白肽治療組(SSPE),分為低劑量組、中劑量組和高劑量組,分別灌胃50、150和250 mg/kg沙棘籽蛋白肽(該劑量依據(jù)此前沙棘籽蛋白降血糖實驗劑量組所設定)[8]。

1.2.3 小鼠檢測指標

1.2.3.1 小鼠精神狀態(tài)的觀察以及體重和血糖的測定 觀察小鼠的生理狀態(tài),毛發(fā)和采食量飲水量和排泄情況,每周測定小鼠體重,選擇小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后的初始體重,以及灌胃第1、4、8周后的體重數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。小鼠尾靜脈取血,用血糖儀和血糖試紙測定每周血糖值,選擇小鼠初始隨機血糖,以及灌胃第1、4、8周后禁食8 h的空腹血糖值進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.2 相關臟器指數(shù)測定 實驗進行8周后,所有動物用乙醚吸入法[14]麻醉,眼球取血放于2 mL離心管中,后脫頸處死實驗鼠,30 min后于4 ℃,3000×g離心10 min,取上層血清。取其腎臟、肝臟、脾臟和心臟稱重,后將臟器、血清液氮速凍儲存在-80 ℃下供后續(xù)實驗分析使用。臟器指數(shù)的計算公式如下:

1.2.3.3 腎功能相關指標的測定 治療8周后,收集24 h尿液。以牛血清白蛋白(BSA)作為標準樣品,采用Bradford法測定尿蛋白含量[15]。采用ELISA試劑盒測定血尿素氮、血清肌酐、血尿酸以及腎組織勻漿中丙二醛的含量。各個指標的測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3.4 腎臟組織病理學檢查 組織學分析:取m/m小鼠、db/db空白對照組和各治療組小鼠的新鮮腎臟,用4%多聚甲醛溶液固定24 h流水沖洗10 h,乙醇梯度脫水處理,二甲苯對腎臟組織進行透明處理;組織石蠟包埋,切片(4 μm),切片腎組織脫蠟,用HE染色,制備成中性樹膠封片后用光片顯微鏡進行全景掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

表1 沙棘籽蛋白肽對臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of SSPE on organ indexes for each group of mice

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗小鼠生理狀態(tài)的觀察

NC組小鼠生理精神都處于活躍狀態(tài),采食量和飲水量正常,排泄量正常(此處數(shù)據(jù)在本文中未呈現(xiàn))。BC組采食量和飲水量明顯增多,排泄量大,到實驗中后期出現(xiàn)便秘的情況。行動遲緩呆滯,毛發(fā)粗糙,甚至局部掉毛現(xiàn)象,墊料潮濕,須3 d更換一次墊料。PC和SSPE治療組生理狀態(tài)有所改善,毛發(fā)順滑有光澤,墊料較為干燥,7 d更換一次墊料即可。

2.2 沙棘籽蛋白肽對小鼠體重的影響

由圖1可知,NC組小鼠體重呈穩(wěn)定增長趨勢,db/db各組小鼠的初始體重無顯著性差異。實驗8周后,BC組小鼠體重顯著低于PC和SSPE治療組(P<0.05),SSPE和PC各組間無顯差異。這一結(jié)果表明,SSPE可有效緩解糖尿病對小鼠造成的多飲多食多尿,體重增長緩慢的不良影響。本實驗結(jié)果與劉洪霞[8]用沙棘籽蛋白處理的db/db小鼠體重變化趨勢保持一致,但與Yuan等利用沙棘籽蛋白處理的STZ誘導的糖尿病小鼠的體重變化有所差別,其結(jié)果是沙棘籽蛋白處理后相較于模型組體重減輕,在一定程度上緩解了糖尿病引起的肥胖癥狀[7]。主要原因可能是實驗原料和動物模型構(gòu)建的差異。

圖1 沙棘籽蛋白肽對小鼠體重的影響Fig.1 The effect of SSPE on the body weights of mice注:*表示與BC組相比有顯著性差異,#表示與PC組相比有顯著性差異,P<0.05；圖2同。

2.3 沙棘籽蛋白對小鼠血糖的影響

由圖2可知,NC組小鼠血糖值穩(wěn)定在一個低水平狀態(tài),無顯著性差異。db/db各組小鼠的初始隨機血糖都處于較高水平。灌胃1周后PC組降糖效果顯著(P<0.05),BC與SSPE組空腹血糖無顯著性差異。實驗進行4周BC組血糖持續(xù)上升,PC、SSPE各組血糖顯著下降。干預8周,SSPE組的血糖值(低中高分別為:19.53、19.94、20.00 mmol/L)顯著低于BC組血糖峰值(29.56 mmol/L)(P<0.05)。SSPE各劑量組與PC組無顯著性差異。與劉洪霞[8]研究的沙棘籽蛋白降血糖效果相比,SSPE后期未出現(xiàn)SSP后期的血糖返升的情況,說明SSPE的降血糖效果可能優(yōu)于沙棘籽蛋白。袁曉晴等[13]研究的癩葡萄蛋白無降血糖活性,但酶水解后可以顯著降低糖尿病小鼠血糖。由此可以推測酶水解提高了SSPE的降血糖活性,因此酶解得到的SSPE的降血糖效果優(yōu)于沙棘籽蛋白。

圖2 沙棘籽蛋白肽對小鼠血糖的影響Fig.2 The effect of SSPE on the glucose values of mice

2.4 沙棘籽蛋白肽對臟器指數(shù)的影響

測定小鼠臟器指數(shù)有助于評估SSPE對糖尿病小鼠的降血糖活性[16]。由表1可知,NC組小鼠各臟器指標均顯著低于BC組(P<0.05),表明糖尿病已經(jīng)造成db/db小鼠不同程度的臟器病變。PC組和SSPE組的腎臟指數(shù)均顯著低于BC組(P<0.05)。近年來,多肽對動物臟器的保護效果逐漸被發(fā)現(xiàn)。張明艷[17]發(fā)現(xiàn)油菜籽抗氧化活性肽具備顯著的抗糖尿病腎臟纖維化的效果。肝臟和脾臟指數(shù)變化趨勢與腎臟指數(shù)變化趨勢相似,龐佳楠[18]研究的酪蛋白抗氧化肽對肝細胞具有顯著的保護作用。

表2 沙棘籽蛋白肽對腎臟相關血清指標的影響Table 2 Effect of SSPE on the kidney related biomarkers

在心臟指數(shù)方面,BC與SSPE各組間無明顯差異,表明SSPE對糖尿病小鼠心臟保護作用不明顯。上述結(jié)果表明SSPE對糖尿病小鼠的腎、肝、脾具有保護作用。這是因為活性肽可以減少氧化應激和炎癥因子,減少TGF-β1的生成,抑制MAPK和核轉(zhuǎn)錄因子相關信號通路,從而對臟器細胞起到保護作用,這與文獻[19-20]報道的類似。

2.5 沙棘籽蛋白肽對腎功能相關指標的影響

圖3 腎臟病理切片(400×)Fig.3 Histological examination of the renal tissues(H&E stained)(400×)注：細箭頭所指區(qū)域為腎小囊，粗箭頭箭頭所指區(qū)域為基底膜。

腎臟丙二醛是脂質(zhì)過氧化物,糖尿病患者體內(nèi)自由基過多,氧化反應劇烈,丙二醛含量較高,是腎臟損傷的指標之一[21]。由表2可知,NC組各項指標都處于較低水平,顯著低于BC組(P<0.05)。SSPE各個劑量組和PC的腎臟丙二醛含量與BC組無顯著性差異,由此可以推測,SSPE抑制丙二醛的效果不顯著,不同蛋白酶作用位點不同,故其水解產(chǎn)物的抗氧化性也有所差別[22-23]。肌酐、尿素氮、尿酸、尿蛋白需要經(jīng)過腎臟代謝[24],當腎臟毛細血管受到損傷,腎小球濾過率下降,通透性增加,這些腎臟相關指標都會升高[25]。SSPE組的肌酐、尿素氮、尿酸、尿蛋白顯著低于BC組(P<0.05),此外,SSPE組的血清肌酐、血清尿酸也顯著低于PC組(P<0.05),由此推測是二甲雙胍作為藥物對腎臟造成了一定的負擔[26]。田穎剛等[27]研究了絲羽烏骨雞活性肽能夠顯著改善因順鉑引發(fā)的腎組織氧化損傷和腎小管壞死。研究表明胰島β細胞分泌的連接肽作為輔助降血糖的活性肽可以逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病初期癥狀,顯著改善腎小球濾過率[28]。由此可以推測,SSPE在具備顯著的降血糖效果的同時可以顯著改善腎小球濾過情況,對腎臟具有一定的保護作用。

2.6 沙棘籽蛋白肽對糖尿病小鼠腎臟病理形態(tài)的影響

由圖3可知,使用HE進行的組織學分析,NC組正常小鼠血細胞分布均勻,腎小球、腎小囊正常無明顯的病理改變;BC組血細胞分布凌亂,腎小囊擠壓性萎縮,基底膜增厚,系膜區(qū)變寬,這些都是糖尿病腎病的典型病理癥狀[29]。SSPE治療可明顯改善上述病變癥狀得到改善,說明SSPE對腎臟起到了一定程度的保護作用,各劑量組間無顯著性差異。腎臟病理切片結(jié)果與上文中的血清、腎臟和尿液參數(shù)結(jié)果一致。推測可能是SSPE顯著的降血糖活性,減少ROS,從而降低了膠原蛋白變性導致的基底膜增厚和細胞間基質(zhì)沉積[19]。

3 結(jié)論

沙棘籽蛋白肽可以顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平,緩解糖尿病引起的腎小球濾過率下降,通透性增加和減輕脂質(zhì)過氧化,并且改善腎小球肥大,基底膜增厚,腎小囊萎縮等癥狀。因此,沙棘籽蛋白肽將來可用于糖尿病的輔助治療。但本論文尚未對沙棘籽蛋白肽進行分離純化,并且其對腎臟保護作用的具體機理也不清楚,這都需要在將來深入探究。