王文珺,葉升鋒,謝艷紅,葉 金,劉學(xué)英,王松雪,李 俊,桑華春,*

(1.北京智云達(dá)科技股份有限公司,北京 100085; 2.湖南工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,湖南株洲 412007; 3.北京眾檢四方檢驗檢測技術(shù)有限公司,北京 102200; 4.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院,北京 100037; 5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081)

糧食中的農(nóng)藥殘留,既來源于田間噴灑的農(nóng)藥,也來源于糧食儲運過程中使用的化學(xué)藥劑,此外,地下水及土壤的農(nóng)藥污染也會遷移到糧食中[1]。有機磷類農(nóng)藥是目前糧食生產(chǎn)存儲過程中廣泛并大量使用的殺蟲劑,其殘留嚴(yán)重危害人、畜及環(huán)境安全[2]。有機磷類農(nóng)藥具有種類多、毒性差異大、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、檢測難度大等特點[3],檢測方法主要有氣相色譜(Gas Chromatography,GC)、液相色譜(Liquid Chromatography,LC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)等大型儀器分析方法[4-6]和酶抑制法(分光光度法)[7-9]等。儀器分析方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏,但檢測成本高、費時、對技術(shù)人員的專業(yè)要求高、適合實驗室分析;而酶抑制法具有操作簡便、快速、滿足現(xiàn)場檢測等優(yōu)點,所以《GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測》[10]等一系列國家標(biāo)準(zhǔn)、農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)都推薦了酶抑制法。但目前酶抑制法的研究和應(yīng)用對象主要是蔬菜、水果中農(nóng)藥殘留的檢測,在糧食中的應(yīng)用較少[7,11]。而且常規(guī)酶抑制法因準(zhǔn)確性及靈敏度等問題,多年來一直存在爭議[12]。對有機磷農(nóng)藥來說,酶抑制法的檢出限常常無法達(dá)到我國糧谷的國家安全限量,其主要技術(shù)原因是硫代磷酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶的不敏感[13]。事實上,有機磷類農(nóng)藥分為磷酸酯類和硫代磷酸酯類兩大類,其中相當(dāng)一部分屬于硫代磷酸酯類農(nóng)藥,這就導(dǎo)致了酶抑制法對有機磷農(nóng)藥的檢出率低[14]。

膽堿酯酶是酶抑制法應(yīng)用的基礎(chǔ),其靈敏度、特異性及穩(wěn)定性直接影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度,因此選擇合適的酶一直是酶抑制法研究的熱點[15-17]。人們常采用乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase,AChE)作為催化酶,但硫代磷酸酯類農(nóng)藥對AChE催化水解功能的抑制效果較差,因此常因靈敏度低而出現(xiàn)漏檢的情況。為提高有機磷的檢出率,本研究對酶抑制法進(jìn)行了改良,選擇對有機磷農(nóng)藥抑制效果較好的丁酰膽堿酯酶(Butyrylcholinesterase,BChE)作為研究對象;使用氧化劑溴代琥珀酰亞胺作為增強劑,以提高檢測靈敏度,實現(xiàn)對糧谷中有機磷農(nóng)藥的有效檢測，以期為我國糧食質(zhì)量安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷物(包括稻谷、小麥、玉米、糙米、雜糧等)陰性樣品 參照《GB/T 5009.20-2003食品中有機磷農(nóng)藥殘留量的測定》[18],糧食樣品經(jīng)氣相色譜法檢測,沒有檢出待測有機磷農(nóng)藥殘留的樣品，樣品來源于北京華聯(lián)超市、北京物美超市及社區(qū)農(nóng)貿(mào)市場等；辛硫磷(phoxim)、對硫磷(parathion)、毒死蜱(chlorpyrifos)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、馬拉硫磷(malathion)、殺螟硫磷(fenitrothion)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、三唑磷(triazophos)、乙硫磷(ethion)等有機磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液 購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶、維生素C(還原劑) 購自sigma公司;溴代琥珀酰亞胺、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、碘化乙酰硫代膽堿、碘化丁酰硫代膽堿 購自Fluka公司;磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、無水乙醇(CH3CH2OH)等 均是分析純試劑,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

ZYD-NP12A農(nóng)藥殘留快速檢測儀 北京智云達(dá)科技股份有限公司;Millpore-Q超純水儀 美國Millipore公司;DCY08-1樣品濃縮儀 常州金昌實驗儀器廠;DM 0412大龍興創(chuàng)離心機 北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH8.0):分別稱取11.9 g無水磷酸氫二鈉、3.2 g磷酸二氫鉀和1.6 g NaCl,充分溶解于1000 mL去離子水中。

顯色劑:分別稱取160 mg 5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)和15.6 mg碳酸氫鈉,于20 mL PBS緩沖溶液中充分溶解,4 ℃保存。

底物溶液:稱取125 mg碘化乙酰硫代膽堿(或137 mg碘化丁酰硫代膽堿),用15 mL去離子水充分溶解后,置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品:用甲醇溶解配制有機磷農(nóng)藥(包括辛硫磷、對硫磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、馬拉硫磷、殺螟硫磷、甲基嘧啶磷、三唑磷、乙硫磷)的母液,濃度為100 μg/mL。使用時,進(jìn)一步稀釋母液;如果標(biāo)準(zhǔn)品溶液用以直接檢測,則用水稀釋,用于加標(biāo)實驗,則用甲醇稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,即農(nóng)藥濃度與酶抑制率關(guān)系。

1.2.2 樣品前處理 將谷物(稻谷、小麥、玉米、糙米、雜糧)樣品粉碎后過20目篩,混勻。稱取(2.0±0.1) g樣品于10 mL離心管中,加6 mL無水乙醇,渦旋2 min,4000 r/min離心5 min。

1.2.3 樣品檢測 取0.25 mL上清液于10 mL離心管中,在60 ℃下氮氣吹干,加入3 mL PB緩沖液和50 μL增強劑,充分混勻后靜置5 min,再加入40 μL還原劑,混勻。若此時溶液比較渾濁,4000 r/min離心5 min,取上清液用于檢測。

根據(jù)檢測樣本數(shù)量,準(zhǔn)備5 mL離心管,增加一個對照管。每管先加入50 μL膽堿酯酶,接著樣品管中加入2.2 mL樣品液,對照管中加入同樣量的提取劑。然后再分別加入70 μL顯色劑,混勻后靜置反應(yīng)10 min后,加入70 μL底物液,立即轉(zhuǎn)移到比色皿中,放入農(nóng)藥殘留檢測儀相應(yīng)的檢測通道,采集3 min后吸光度變化值,由農(nóng)殘儀自動得出樣本的抑制率。

抑制率I(inhibition rate)=(ΔA0-ΔA)/ΔA0

其中:ΔA0是對照樣本反應(yīng)3 min后吸光度變化值,ΔA是待測樣本反應(yīng)3 min后吸光度變化值。當(dāng)抑制率等于50%時(IC50),檢測樣品中農(nóng)藥的濃度即為檢測限。

1.2.4 提取溶劑的選擇 對比分別使用PBS、乙醇和乙酸乙酯作為樣品提取溶劑的提取效果。使用乙酰膽堿酯酶作為水解酶,比較在小麥、大米陰性樣品中添加有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷、殺螟硫磷、乙硫磷和辛硫磷,在酶活性被50%抑制時(檢測限)使用農(nóng)藥的濃度,選擇適合的提取劑。

表2 硫代磷酸脂類農(nóng)藥對不同膽堿酯酶抑制率的影響Table 2 The inhibition rate changes of the dithiophosphate pesticides using different enzymes

1.2.5 膽堿酯酶的選擇 在大米和小麥陰性樣本中,分別添加不同濃度的辛硫磷、乙硫磷、殺螟硫磷和毒死蜱,以乙醇為提取溶劑,檢測有機磷農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BChE)的抑制情況,根據(jù)抑制率和穩(wěn)定性,選擇催化效果好的水解酶用于后續(xù)研究。

1.2.6 增強劑的選擇 使用溴代琥珀酰亞胺作為增強劑,對比不使用增強劑時,兩者靈敏度的差異。靈敏度和檢測限的差別在于:靈敏度針對標(biāo)準(zhǔn)溶液而言的,檢測限是針對檢測樣本。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 使用不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用Origin 8.5 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,建立四參數(shù)回歸方程。

1.3 數(shù)據(jù)分析

由1.2.3得到的抑制率,可以實現(xiàn)對待測樣品農(nóng)藥殘留的定性分析,但如果希望得到定量檢測結(jié)果,就需要做進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。本研究采用軟件Origin 8.5繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下:

其中:Y為抑制率,X為農(nóng)藥濃度,A1代表檢測范圍內(nèi)最低檢測濃度有機磷農(nóng)藥的抑制率,A2是檢測范圍內(nèi)最高檢測濃度有機磷農(nóng)藥的抑制率,P為曲線拐點的斜率,X0為IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

樣品的前處理是酶抑制反應(yīng)的關(guān)鍵步驟,選擇合適的提取溶劑,可以有效提取待測農(nóng)藥,避免提取過程中破壞待測物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或酶的活性。本研究通過對PBS、乙醇和乙酸乙酯提取有機磷農(nóng)藥的效果進(jìn)行分析,得到的方法檢測限如表1所示。一般來說,固定其他條件,檢測限值越低說明提取效果越好,即使用的提取溶劑效果最佳。使用乙醇作為提取劑,不同農(nóng)藥的檢測限的范圍為0.2～8.1 mg/kg,明顯低于使用PBS和乙酸乙酯的檢測限:1.2～22.4和0.8～16.8 mg/kg,因此,在后續(xù)研究中使用乙醇作為提取劑。

表1 不同提取溶劑的比較Table 1 The comparison of the different extraction methods

2.2 膽堿酯酶的選擇

一般認(rèn)為,有機磷類農(nóng)藥可與膽堿酯酶(ChE)酯解部位絲氨酸的羥基共價結(jié)合,形成了磷?；憠A酯酶,降低了ChE酶促水解底物的能力,從而達(dá)到了抑制酶活性的效果[16]。本研究對ChE受有機磷農(nóng)藥抑制的效果進(jìn)行分析,包括蒼蠅頭部提取的乙酰膽堿酯酶(AChE)和馬血清提取的丁酰膽堿酯酶(BChE),BChE在結(jié)構(gòu)上與AChE類似,但BChE對底物的特異性和抑制的敏感性與AChE不同。本研究根據(jù)糧食生產(chǎn)存儲中使用農(nóng)藥的種類,在陰性糧食樣本中添加不同濃度的常用有機磷農(nóng)藥。由表2可知,不同濃度的有機磷農(nóng)藥對BChE的抑制率范圍是33.8%±2.5%～96.1%±1.4%,穩(wěn)定性范圍(變異系數(shù))是1.5%～8.1%,而對應(yīng)濃度的有機磷農(nóng)藥對AChE的抑制率范圍是15.7%±2.2%～67.9%±4.3%,穩(wěn)定性范圍是6.3%～14.2%。顯然,有機磷農(nóng)藥對BChE的抑制率和穩(wěn)定性都明顯優(yōu)于AChE,所以在后續(xù)研究中使用BChE作為水解酶。

表4 硫代磷酸脂類農(nóng)藥的曲線方程和決定系數(shù)Table 4 Common organphosphorus pesticides curve equation and determination coefficient

2.3 增強劑對硫代磷酸脂類農(nóng)藥抑制效果

增強劑在酶抑制法中起到了強氧化劑的作用,最初人們利用氯化物的氧化性作為增強劑[19],但現(xiàn)在趨向使用安全性較高的溴化物作為增強劑。硫代磷酸脂類農(nóng)藥經(jīng)增強劑氧化后,其中的P=S基團變成了對膽堿酯酶敏感的P=O基團,提高了對酶的抑制效果[20]。如表3所示,使用溴代琥珀酰亞胺作為增強劑,能明顯改善硫代磷酸脂類農(nóng)藥對BChE的抑制,提高了檢測的靈敏度。靈敏度是酶活性被50%抑制(IC50)時標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的濃度。

表3 硫代磷酸脂類農(nóng)藥用增強劑處理前后抑制率變化的比較Table 3 The inhibition rate changes of thedithiophosphate pesticides treated by enchancer

2.4 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立

根據(jù)GB/T 5009.199-2003,當(dāng)被測樣品的抑制率≥50%時,可判斷為陽性[10]。如圖1和表4,在優(yōu)化條件下,對硫磷、辛硫磷、毒死蜱和三唑磷對馬血清BChE的抑制中濃度IC50(50%抑制時,有機磷農(nóng)藥的濃度)分別為0.01、0.11、0.16和0.03 μg/L,低于相關(guān)報道的檢測限值[11],標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線由Origin分析軟件得到,決定系數(shù)(R2)>0.98,基本滿足了谷物中農(nóng)藥殘留的國家檢測要求。曾有人提出參考競爭性酶聯(lián)免疫,把農(nóng)藥殘留的檢測限定為IC20[21-22],以彌補酶抑制法靈敏度的不足,這一想法已在立項的糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(LS)中得到貫徹。但在本實驗中,因為使用了增強劑及選擇了敏感的膽堿酯酶,IC50作為檢測限已基本滿足了檢測要求,而且使用IC50作為檢測限更穩(wěn)定[23]。

表5 谷物中農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果Table 5 The amount of pesticide residues in grains

圖1 硫代磷酸脂類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線 Fig.1 The inhibition curve of organphosphorus pesticides

2.5 糧食中有機磷農(nóng)藥殘留檢測

對北京地區(qū)不同來源的200個糧食樣品進(jìn)行檢測,每個樣品設(shè)置三個重復(fù),檢測結(jié)果與氣相色譜進(jìn)行比對。其中12個樣本經(jīng)氣相色譜確證為陽性,186個樣品兩種檢測方法都為陰性。糧食的基質(zhì)比較簡單,基本不含對酶有抑制作用的活性物質(zhì),由此產(chǎn)生假陽性的幾率相對較低;但酶抑制法檢測的是有機磷和氨基甲酸酯類的總量,得到的是多種農(nóng)藥殘留的總量,如果種植和存儲過程中使用了多種農(nóng)藥,則可能出現(xiàn)假陽性(如樣本S76),因此,酶抑制法更適合受檢樣品只施用了某一種農(nóng)藥的情況。此外,對于少數(shù)農(nóng)藥來說,酶抑制法的檢測限沒有達(dá)到GB 2763-2019的限量要求,因此會導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。比如本研究中,水胺硫磷的檢測限是0.1 mg/kg,而國家安全限量0.05 mg/kg,在0.05～0.1 mg/kg范圍內(nèi),檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陰性(如樣本S234)。由表5可見,酶抑制法檢測的200份樣品中,187份為陰性,13份為陽性;按照《GB/T 5009.20-2003食品中有機磷農(nóng)藥殘留量的測定》推薦的氣相色譜法檢,測結(jié)果為187份為陰性,13份為陽性。兩種檢測方法的陰性符合率為99%,陽性符合率為85%?？傮w樣本符合率98%,較以前的研究報道有了很大的進(jìn)步[24];同時說明北京地區(qū)糧食農(nóng)藥殘留污染情況遠(yuǎn)低于全國平均水平[11]。

3 結(jié)論

于2019年8月頒布的GB 2763-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》,規(guī)定了483種農(nóng)藥在356類食品中7107個殘留限量,基本涵蓋了我國已批準(zhǔn)使用的常用農(nóng)藥和居民日常消費的主要農(nóng)產(chǎn)品,其中谷物及其產(chǎn)品占據(jù)1/4[13]。建立有效檢測糧食中有機磷類農(nóng)藥殘留快檢方法,對于糧食質(zhì)量安全的管控具有重要的意義。硫代磷酸酯類農(nóng)藥,具有最大殘留限量低、對乙酰膽堿酯酶不敏感的特點,常規(guī)酶抑制法的檢出限往往達(dá)不到國家安全限量要求,甚至根本無法檢出。本研究通過選擇合適的樣品提取體系、使用增強劑、選擇對有機磷類農(nóng)藥敏感的丁酰膽堿酯酶等,提高了檢測靈敏度,實現(xiàn)了對有機磷農(nóng)藥殘留的有效、快速檢測,最大程度避免了漏檢。但本研究改良的方法依然無法滿足全部有機磷農(nóng)藥的檢測限要求,導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性,后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化條件,提高檢出率。