曾 穎,張亞楠,曾 臻,陳仲巍,余莉莉,吳娟英

(廈門(mén)醫(yī)學(xué)院,福建廈門(mén) 361023)

雙水相萃取技術(shù)(aqueous two-phase extraction,ATPE)因其操作簡(jiǎn)單、條件溫和、易于連續(xù)操作與擴(kuò)大等特點(diǎn)成為近年來(lái)被廣泛關(guān)注和應(yīng)用的新型分離技術(shù),且由于其系統(tǒng)中高達(dá)70%～80%的含水量能保護(hù)和穩(wěn)定生物活性物質(zhì)在分離過(guò)程中不變性和失活的這一優(yōu)勢(shì)[1-3],更使其能在如酶[4]、蛋白質(zhì)[5]、病毒[6]、核酸[7]等生物產(chǎn)品[8]和天然產(chǎn)物[9]的提取與分離中被廣泛應(yīng)用。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,CE3.2.1.21)是一種能催化水解芳基和烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶,該酶對(duì)水解纖維素及合成紅景天苷有重要的作用。目前關(guān)于β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在微生物[10],也有部分植物、動(dòng)物和水生生物[11],提取純化方法常采用超聲波[12-13]、透析[14]、柱層析[15]等常規(guī)方法為主。有研究發(fā)現(xiàn),鮑魚(yú)內(nèi)臟中含有多種消化酶[16-17],其中就含有豐富的β-葡萄糖苷酶[18-19]。鮑魚(yú)的加工和食用主要以腹足為主,而占其總重30%左右的臟器大部分被丟棄,為提升鮑魚(yú)內(nèi)臟的應(yīng)用價(jià)值,將其變廢為寶,本研究選用鮑魚(yú)內(nèi)臟為原料,探索從鮑魚(yú)內(nèi)臟中萃取分離β-葡萄糖苷酶效果最佳的PEG/鹽雙水相體系構(gòu)成,同時(shí)采用正交試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,并探究體系pH、樣品加入量、超聲波輔助等影響因素對(duì)萃取效果的影響,從而獲得一條雙水相體系分離提取鮑魚(yú)內(nèi)臟中β-葡萄糖苷酶的創(chuàng)新型分離提取技術(shù)路線,為目前雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用提供思路啟發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺紋盤(pán)鮑內(nèi)臟 廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院提供,-20 ℃下冷凍儲(chǔ)藏待用;對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG) 北京索萊寶科技有限公司;對(duì)硝基苯酚、碳酸鈉、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、檸檬酸、乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉(均為分析純)、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)600、1000、1500、2000、4000 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

A25乳化機(jī) 上海歐河;Scientz-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司;3-18K高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma;AF100制冰機(jī) 意大利斯科茨曼;Epoch 2酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio Tek。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鮑魚(yú)內(nèi)臟的預(yù)處理 取一定質(zhì)量的鮑魚(yú)內(nèi)臟,以1∶4的質(zhì)量比加入預(yù)冷的乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH=5.0)[18],在冰浴中用組織搗碎機(jī)勻漿后,冰浴浸提1 h后,用高速冷凍離心機(jī)離心(10000 r/min,4 ℃,15 min),取上清液(粗酶液)待用。

1.2.2 雙水相體系的構(gòu)建與優(yōu)化

1.2.2.1 雙水相體系中鹽種類(lèi)的確定 取4支15 mL的刻度離心管,分別加入2.5 g 40% PEG1500原液,2 g不同的鹽粉末(磷酸二氫鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉)及1 g的粗酶液后,加水補(bǔ)至體系總質(zhì)量為10 g,使雙水相體系PEG1500的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。充分搖勻溶解后,4 ℃下5000 r/min離心3 min,體系分相后記錄上下相體積,分別取100 μL上相與下相液體,測(cè)定其酶活力和蛋白含量。

1.2.2.2 PEG/NaH2PO4相圖的繪制 分別將不同分子量的PEG(600、1000、1500、2000、4000)與NaH2PO4制成一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原液,根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]的方法,對(duì)不同分子量PEG/NaH2PO4體系選取一系列分相臨界點(diǎn),繪制雙水相相圖。

1.2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以1.2.2.1中所述方法,選取影響雙水相體系萃取效果的幾種主要考察因素及條件:PEG分子量(600、1000、1500、2000、4000)及不同PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%～20%范圍內(nèi)以2%間隔遞增)和NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(13%～25%范圍內(nèi)以1%間隔遞增);體系pH(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5);粗酶液加入量(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 g)。分別測(cè)定不同雙水相體系的上、下相的體積、酶活及蛋白等參數(shù),通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與比較,探究從鮑魚(yú)內(nèi)臟中萃取分離β-葡萄糖苷酶的最佳雙水相體系的構(gòu)成條件及規(guī)律。

1.2.2.4 正交試驗(yàn) 在上述雙水相體系構(gòu)成的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取影響試驗(yàn)的3個(gè)主要因素,在各因素選取3個(gè)最佳的水平條件,采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)做三因素三水平正交試驗(yàn),從而對(duì)1.2.2.3中的結(jié)果進(jìn)行比較及驗(yàn)證。分別選取影響試驗(yàn)的3個(gè)主要因素:PEG分子量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為考察因素,各因素水平選取不僅需要在最佳水平范圍內(nèi)選取,還必須滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)組均能成相,體系對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果較好的3個(gè)水平條件選取見(jiàn)表1。

表1 雙水相體系β-葡萄糖苷酶正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Extraction factors and levels of orthogonaltest of the ultrasonic assisted β-glucosidase

1.2.2.5 超聲波輔助提取 在制備組成相同的10 g雙水相體系的步驟中,加入超聲波聯(lián)合處理[21-22],探究超聲波輔助對(duì)雙水相萃取β-葡萄糖苷酶的效果影響。實(shí)驗(yàn)分三組,A:PEG+粗酶液+水混勻,180 W超聲處理5 min后加入NaH2PO4,混勻靜置離心分相;B:NaH2PO4+粗酶液+水混勻,180 W超聲處理5 min后加入PEG,混勻靜置離心分相;C:PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混勻,180 W超聲處理5 min后,靜置離心分相。

1.2.3 酶活力與蛋白含量的測(cè)定 采用p-NPG比色法,在403 nm處的吸光值來(lái)測(cè)定β-葡萄糖苷酶的酶活力大小[23]。酶活定義:一定條件下,1 mL酶液在1 min內(nèi)水解p-NPG產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯酚(p-nitrophenol)定義為一個(gè)酶活力單位(U),標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:y=16.115x+0.0243,R2=0.999 蛋白質(zhì)含量采用Brandford法進(jìn)行測(cè)定[24],標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為:y=0.435x+0.456,R2=0.998。

實(shí)驗(yàn)探究過(guò)程中,由于目標(biāo)酶集中富集于下相,酶活的評(píng)價(jià)指標(biāo)以下相為主,計(jì)算公式如下[25]:

(上)下相總酶活(U)=(上)下相酶活(U/mL)×(上)下相體積(mL)

下相酶比活(U/mg)=下相酶活(U/mL)/下相蛋白(mg/mL)

相比R=下相體積/上相體積;

分配系數(shù)K=下相總酶活/上相總酶活;

萃取率Y=(R×K)/(1+R×K)

純化倍數(shù)PF=下相酶比活/粗酶液酶比活

1.3 數(shù)據(jù)處理

三次實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)平均值及標(biāo)準(zhǔn)差采用Microsoft Office Excel 2010進(jìn)行計(jì)算,并使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ V3.1專(zhuān)業(yè)版進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系中鹽的種類(lèi)對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響

如圖1所示,以10%PEG1500與20%的不同鹽分別構(gòu)建雙水相體系對(duì)粗酶液進(jìn)行萃取分離,NaH2PO4的酶活最高,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇NaH2PO4作為雙水相中的鹽相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同鹽種類(lèi)對(duì)β-葡萄糖苷酶的萃取效果Fig.1 The effect of different types of salton extraction of β-glucosidase

2.2 PEG/NaH2PO4雙水相體系總相圖的繪制

分別繪制PEG600、1000、1500、2000、4000相圖,合并后得總相圖,如圖2所示。

圖2 PEG/NaH2PO4雙水相相圖Fig.2 Phase diagram of PEG/NaH2PO4aqueous two-phase system

相圖的雙節(jié)線上方是兩相成相區(qū),該區(qū)域作為選取PEG和NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量的依據(jù)。若只依據(jù)單一分子量的PEG相圖進(jìn)行單因素變量(PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù))實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),則實(shí)驗(yàn)的可信度不高。這是由于雙水相的成相特殊性,三個(gè)因素之間存在相互間的影響及作用關(guān)系,體系的構(gòu)成及最終萃取效果是在雙水相成相后三者同時(shí)作用的結(jié)果,因此,1.2.2.3中單因素實(shí)驗(yàn)中變量的選擇必須以綜合相圖(圖2)為依據(jù),分別對(duì)PEG600/1000/1500/2000/4000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的選取和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。2.3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為固定體系中PEG分子量,在其對(duì)應(yīng)的PEG雙節(jié)線上方(成相)區(qū)域間隔2%依次選取五個(gè)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為固定點(diǎn),同時(shí)以該P(yáng)EG雙節(jié)線上成相臨界點(diǎn)的NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為起點(diǎn),依次遞增1%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和比較,并從每張結(jié)果圖中選取最佳的雙水相體系進(jìn)行重復(fù)綜合驗(yàn)證,得到的每種PEG中最佳體系組成,最后再做綜合比較,以此確定最佳的雙水相體系構(gòu)成。

2.3 雙水相體系的構(gòu)成對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響

2.3.1 PEG600對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG600的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、14%、16%、18%、20%,以體系剛好成相的NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為起點(diǎn),以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù),選擇12%為探究起點(diǎn)是因?yàn)楫?dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于12%,則雙水相成相及后續(xù)探究時(shí)所需NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大,導(dǎo)致分相后上相體積過(guò)小,不利于測(cè)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示;分別選取圖3中最佳的體系點(diǎn)進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)比較,結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的PEG600/NaH2PO4雙水相體系對(duì)β-葡萄糖苷酶分配系數(shù)的影響Fig.3 The effect of PEG600/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的PEG600/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.4 The comprehensive comparison of PEG600/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with different massfraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖3可以看出,12%PEG600組成的雙水相體系總體分配系數(shù)大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當(dāng)固定PEG600的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,隨著NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)逐漸下降。圖4選取圖3中分配系數(shù)最高的體系組合進(jìn)行綜合比較,PEG600對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為12% PEG600+21% NaH2PO4。

由圖3和圖4可見(jiàn),PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越接近其相應(yīng)的成相雙節(jié)線時(shí),下相對(duì)β-葡萄糖苷酶的萃取效果越好,即最佳體系出現(xiàn)在其雙節(jié)線成相臨界點(diǎn)處,而隨著PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,其萃取效果逐漸下降。

2.3.2 PEG1000對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、12%、14%、16%、18%,以體系剛好成相的NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為起點(diǎn),以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖5所示;分別選取圖5中最佳的體系點(diǎn)進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)比較,結(jié)果如圖6所示。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的PEG1000/NaH2PO4雙水相體系對(duì)β-葡萄糖苷酶分配系數(shù)的影響Fig.5 The effect of PEG1000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different massfraction levels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平PEG1000/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.6 The comprehensive comparison of PEG1000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with different massfraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖5可以看出,10% PEG1000組成的雙水相體系總體分配系數(shù)最大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當(dāng)固定PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,隨著NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)在第一點(diǎn)和第二點(diǎn)出現(xiàn)峰值,隨后逐漸下降。圖6選取圖5中分配系數(shù)最高的體系組合進(jìn)行綜合比較,10% PEG1000+20% NaH2PO4的組合對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳。

由圖5可見(jiàn),PEG1000的分配行為與PEG600相比略有變化,隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,最佳萃取體系組成略有后移,但雙水相體系組成在其雙節(jié)線附近時(shí),下相對(duì)β-葡萄糖苷酶的萃取效果越好,且隨著PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,其萃取效果逐漸下降。

2.3.3 PEG1500對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG1500的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、12%、14%、16%、18%,以體系剛好成相的NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為起點(diǎn),以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖7所示;分別選取圖7中最佳的體系點(diǎn)進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)比較,結(jié)果如圖8所示。

圖7 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的PEG1500/NaH2PO4雙水相體系對(duì)β-葡萄糖苷酶分配系數(shù)的影響Fig.7 The effect of PEG1500/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖8 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平PEG1500/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.8 The comprehensive comparison of PEG1500/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖7可以看出,10% PEG1500組成的雙水相體系總體分配系數(shù)大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當(dāng)固定PEG1500的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,隨著NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)在第二點(diǎn)出現(xiàn)峰值,隨后逐漸下降。圖8選取圖7中分配系數(shù)最高的體系組合進(jìn)行綜合比較,發(fā)現(xiàn)雖然分配系數(shù)上10%+18%的組成最高,但下相β-葡萄糖苷酶酶活及純化倍數(shù)最高的是12%+17%的組成,在下相萃取率相近的情況下,PEG1500對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為12% PEG1500+17% NaH2PO4。

由圖7和圖8可見(jiàn),PEG1500的最佳分配行為點(diǎn)不再是雙節(jié)線上的成相點(diǎn),均發(fā)生后移,隨著PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大,下相對(duì)β-葡萄糖苷酶的萃取效果先增后降,且最佳點(diǎn)均出現(xiàn)在考察的第二個(gè)雙水相體系構(gòu)成點(diǎn)。

2.3.4 PEG2000對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、12%、14%、16%、18%,以體系剛好成相的NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為起點(diǎn),以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖9所示;分別選取圖9中最佳的體系點(diǎn)進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)比較,結(jié)果如圖10所示。

圖9 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的PEG2000/NaH2PO4雙水相體系對(duì)β-葡萄糖苷酶分配系數(shù)的影響Fig.9 The effect of PEG2000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖10 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平PEG2000/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.10 The comprehensive comparison of PEG2000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖9可以看出,10%和12% PEG2000組成的雙水相體系總體分配系數(shù)相近且均較大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而當(dāng)固定PEG2000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,隨著NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)在第二點(diǎn)或第三點(diǎn)出現(xiàn)峰值,隨后逐漸下降。圖10選取圖9中分配系數(shù)最高的體系組合進(jìn)行綜合比較,發(fā)現(xiàn)雖然分配系數(shù)、下相β-葡萄糖苷酶酶活、下相萃取率均最高,因此,PEG2000對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為10% PEG2000+18% NaH2PO4。

規(guī)律總結(jié):圖9可見(jiàn),PEG2000的分配系數(shù)規(guī)律發(fā)生較大改變,下相萃取效果最佳的體系組成相較于前三者有遠(yuǎn)離雙節(jié)線的趨勢(shì),即PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加范圍在1%～4%之間,萃取效果更好,但超過(guò)此范圍后,萃取效果隨之下降。且其分配系數(shù)較前三者迅速增大,這是由于β-葡萄糖苷酶在上相分配極少,更多富集中于下相,且兩相分相處富集出現(xiàn)較為明顯的雜質(zhì)薄層。由圖10可見(jiàn),雙水相體系的萃取效果隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降。

2.3.5 PEG4000對(duì)萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響 分別固定PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%、10%、12%、14%、16%,以體系剛好成相的NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為起點(diǎn),以1%的變化量依次遞增NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果如圖11所示;分別選取圖11中最佳的體系點(diǎn)進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)比較,結(jié)果如圖12所示。

圖11 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的PEG4000/NaH2PO4雙水相體系對(duì)β-葡萄糖苷酶分配系數(shù)的影響Fig.11 The effect of PEG4000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

圖12 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平PEG4000/NaH2PO4最佳雙水相體系綜合比較Fig.12 The comprehensive comparison of PEG4000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由圖11可以看出,10%和12%PEG4000組成的雙水相體系總體分配系數(shù)總體較高;而當(dāng)固定PEG4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)后,隨著NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,分配系數(shù)分別在前四點(diǎn)都出現(xiàn)過(guò)峰值,隨后逐漸下降。圖12選取圖11中分配系數(shù)最高的體系組合進(jìn)行綜合比較,在分配系數(shù)相近的情況下,下相β-葡萄糖苷酶酶活最高的是12%+15%的組成,因此,PEG4000對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的雙水相體系組成為12% PEG4000+15% NaH2PO4。

PEG4000與PEG2000有相似的規(guī)律,且由圖11可見(jiàn),PEG4000總體的分配系數(shù)顯著提升,說(shuō)明目標(biāo)酶大量富集于下相且酶活較高,而上相目標(biāo)酶極少。最佳雙水相萃取體系組成則隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先平穩(wěn)后緩慢下降的趨勢(shì)。

2.3.6 不同PEG分子量的最佳雙水相體系綜合比較 分別選取圖4、6、8、10、12中萃取效果(下相總酶活、下相純化倍數(shù)及萃取率)最佳的雙水相體系組成—Ⅰ:12% PEG600+21% NaH2PO4;Ⅱ:10%PEG1000+20% NaH2PO4;Ⅲ:12% PEG1500+17% NaH2PO4;Ⅳ:10% PEG2000+18% NaH2PO4;Ⅴ:12% PEG4000+15% NaH2PO4。在相同的環(huán)境條件下同時(shí)進(jìn)行比較,經(jīng)過(guò)三次平行實(shí)驗(yàn)后,綜合平均結(jié)果如圖13所示。

圖13 對(duì)β-葡萄糖苷酶有最佳萃取效果的雙水相體系綜合比較Fig.13 The comprehensive comparison of aqueoustwo-phase systems with optimalextraction effect on β-glucosidase

圖13中,體系Ⅴ的實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳,雙水相體系構(gòu)成為12% PEG4000+15% NaH2PO4時(shí)對(duì)粗酶液有最佳萃取效果,實(shí)驗(yàn)過(guò)程是較為全面的對(duì)雙水相體系組成進(jìn)行系統(tǒng)探究,可信度較高。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

表4 雙水相最優(yōu)組合比較Table 4 The comprehensive comparison of optimal aqueous two-phase systems

2.4 最佳雙水相體系的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。方差分析見(jiàn)表3。

表2 雙水相體系β-葡萄糖苷酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result on the orthogonal test of theultrasonic assisted β-glucosidase extraction

通過(guò)表2的極差R可知,RA

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,探究雙水相最佳體系組成的正交試驗(yàn)存在一定的局限性,最終結(jié)果與實(shí)際結(jié)果有偏差,這是由于雙水相體系成相的特殊性,影響雙水相體系組成的因素水平不能簡(jiǎn)單的以單因素組合進(jìn)行設(shè)計(jì),不但需要考慮各因素水平所組成的體系實(shí)驗(yàn)組是否都能成相,還需考慮所選擇的因素水平是否在其最優(yōu)水平范圍內(nèi)。但若因素水平選擇只考慮最優(yōu)范圍,則可能導(dǎo)致出現(xiàn)無(wú)法成相的實(shí)驗(yàn)組,反之,若只考慮是否成相來(lái)選擇因素水平,則對(duì)于不同分子量的PEG來(lái)說(shuō),因素水平并未都在其最優(yōu)水平范圍內(nèi)。若同時(shí)進(jìn)行比較,便不具有代表性,無(wú)法說(shuō)明結(jié)果為最優(yōu)體系組成。因此,通過(guò)2.3的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果總結(jié)出的規(guī)律,作為雙水相最佳體系選擇依據(jù)則更為可信。

2.5 雙水相體系pH對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響

改變12% PEG4000+15% NaH2PO4最佳雙水相體系的pH,探究pH對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響。由于測(cè)量需要,將總體系按比例擴(kuò)大至20 g。結(jié)果如下圖14所示。

圖14 體系pH對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響Fig.14 The effect of pH value on extraction of β-glucosidasewith aqueous two-phase system

如圖14所示,當(dāng)雙水相體系pH為3.5時(shí),即該雙水相體系未經(jīng)調(diào)節(jié)的體系自然pH,下相β-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)出最高酶活,萃取率最高。這可能是由于該pH在β-葡萄糖苷酶的最適pH范圍內(nèi)[26],而通過(guò)加入HCl或NaOH改變體系自然pH后,此時(shí)加入的HCl或NaOH使體系的構(gòu)成發(fā)生改變,且分相后上、下相pH會(huì)再次發(fā)生改變,不利于β-葡萄糖苷酶的酶活力回收。

2.6 雙水相體系中樣品加入量對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響

改變12% PEG4000+15% NaH2PO4最佳雙水相體系的樣品(粗酶液)的加入量,探究總質(zhì)量為10 g的雙水相體系對(duì)樣品的最大處理量。結(jié)果如圖15所示。

圖15 樣品加入量對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響Fig.15 The effect of sample quantity on extraction ofβ-glucosidase with aqueous two-phase system

當(dāng)樣品加入量小于等于2 g時(shí),下相酶活呈線性遞增,酶比活也呈遞增趨勢(shì);下相萃取率及分配系數(shù)略有下降;當(dāng)粗酶加入量大于2 g之后,酶比活不再增加,下相酶活增量明顯減緩,下相萃取率和分配系數(shù)快速下降,此現(xiàn)象說(shuō)明粗酶加入量一超過(guò)了該雙水相體系萃取能力的最大載荷,因此可以確定總質(zhì)量為10 g的該雙水相體系的最大處理量為2 g,即該雙水相體系對(duì)粗酶液的最大處理量為體系總質(zhì)量的20%。

2.7 超聲波輔助雙水相對(duì)β-葡萄糖苷酶萃取效果的影響

對(duì)雙水相技術(shù)萃取過(guò)程中進(jìn)行超聲波處理與未進(jìn)行超聲波處理的萃取效果的比較,結(jié)果如下圖16所示。

圖16 超聲波輔助雙水相萃取β-葡萄糖苷酶效果的影響Fig.16 The effect of ultrasonic assisted on extraction ofβ-glucosidase with aqueous two-phase system

經(jīng)過(guò)超聲波處理的雙水相體系總體參數(shù)水平略?xún)?yōu)于無(wú)超聲處理體系,其中,C實(shí)驗(yàn)方法:PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混勻后再超聲,能略微提高目標(biāo)酶的萃取效果。因此可以考慮在雙水相萃取過(guò)程中加入超聲波輔助萃取。但就經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)驗(yàn)成本考慮,不建議增加該輔助步驟。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)鮑魚(yú)內(nèi)臟中β-葡萄糖苷酶的分離提取效果最佳、獲得酶活最高、回收率最高的PEG/NaH2PO4雙水相體系組成為:12% PEG4000+15% NaH2PO4;該體系pH對(duì)雙水相體系萃取效果存在影響,體系自然狀態(tài)下的pH即為最適pH;該雙水相體系的飽和處理量為總體系的20%;雙水相萃取過(guò)程中加入超聲輔助能夠略微提高β-葡萄糖苷酶的酶活和回收率,即PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混勻后,超聲波180 W處理5 min。

通過(guò)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),雙水相體系萃取目標(biāo)酶存在一定規(guī)律:PEG分子量越大,目標(biāo)酶于下相的分配系數(shù)越大,萃取效果越好。同一PEG分子量中,隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,萃取效果總體上呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì),即最佳雙水相體系PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)組成可在其相圖雙節(jié)線附近選取。利用該規(guī)律可將類(lèi)似探究雙水相萃取蛋白質(zhì)的最佳體系組成的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法進(jìn)行簡(jiǎn)化:若選擇PEG600、PEG1000 和PEG1500時(shí)只需探究PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在雙節(jié)線上方0%～2%的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)遞增進(jìn)行實(shí)驗(yàn),即可找到最佳體系;若選擇PEG2000和PEG4000,則PEG和鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)遞增的實(shí)驗(yàn)范圍在1%～4%以?xún)?nèi),在此范圍內(nèi)進(jìn)行比較試驗(yàn)即可快速且精準(zhǔn)找到最佳體系。

上述規(guī)律的形成和機(jī)理有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究和解釋,但在雙水相萃取技術(shù)中,該規(guī)律的總結(jié)對(duì)最佳雙水相體系的選擇上具有一定的參考價(jià)值。該規(guī)律也為在生物分離方法中選用雙水相萃取技術(shù)提供了一個(gè)較為可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新的研究思路。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探索中,將進(jìn)一步探究該規(guī)律的適用范圍及其機(jī)理成因,同時(shí)還將嘗試探究雙水相二次萃取技術(shù)的應(yīng)用方法及規(guī)律。