楊 昭,姚玉靜,黃佳佳,梁志理,梁瑞進(jìn),陳麗珊,梁健平

(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院食品學(xué)院,廣東廣州 510520)

牡蠣(oyster)又名生蠔、海蠣子等,是一種低脂肪高蛋白的海產(chǎn)品,其肉嫩味鮮,營養(yǎng)豐富,是我國重要的大宗水產(chǎn)品[1]。近年來研究報(bào)道牡蠣及其酶解產(chǎn)物具有抑菌、抗疲勞、抗氧化、降血脂、降血壓等多種生理活性,因此在功能性食品開發(fā)領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值[2-3]。基于牡蠣酶解產(chǎn)物良好的功能,運(yùn)用蛋白質(zhì)酶解技術(shù)處理牡蠣制備呈味肽和生物活性肽,獲得越來越多學(xué)者的關(guān)注[4-5]。

蛋白質(zhì)酶解是復(fù)雜的過程,受多種因素的影響,如蛋白質(zhì)種類、酶的種類、酶解條件(料液比、酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間)和酶滅活條件[6]。其中蛋白質(zhì)種類和酶的種類是影響酶解產(chǎn)物組成的重要因素,不同的蛋白酶有不同的酶切位點(diǎn),會引起酶解產(chǎn)物氨基酸組成、肽的結(jié)構(gòu)和肽分子量的差別。探究蛋白酶種類對牡蠣酶解產(chǎn)物的影響顯得尤為重要。馮丹丹等[7]研究了菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶對太平洋牡蠣的氨基態(tài)氮、總酸、礦質(zhì)元素及?；撬岷康挠绊?。侯清娥[8]采用胃蛋白酶、Alcalase 2.4L、胰蛋白酶、動物蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶酶和復(fù)合酶在相同條件下分別對牡蠣蛋白進(jìn)行水解6 h,考察了不同蛋白酶對牡蠣酶解產(chǎn)物水解度、感官、蛋白質(zhì)利用率、肽含量和肽分子量分布的影響。然而,上述研究中不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物水解度是不同的。水解度是衡量水解程度的重要指標(biāo)。酶解產(chǎn)物水解度不同,其肽分子量分布和游離氨基酸含量必然不同。因此無法判斷酶解產(chǎn)物的特性差異是蛋白酶種類引起的,還是水解度不同引起的。為考察不同蛋白酶對牡蠣酶解產(chǎn)物滋味特性的影響,篩選合適的水解蛋白酶,有必要在水解度一致的條件下對比蛋白酶對酶解產(chǎn)物特性的影響,但目前未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以牡蠣為原料,通過控制水解時(shí)間,獲得水解度一致的酶解產(chǎn)物,探究五種常用商用蛋白酶(胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)對酶解產(chǎn)物感官、肽分子量和游離氨基酸的影響,以期為牡蠣酶解產(chǎn)物在保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣 購于廣州黃沙水產(chǎn)市場,開殼取肉,攪碎均勻后分裝于封口袋中,-18 ℃凍藏備用;風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g) 諾維信中國公司;堿性蛋白酶(20萬U/g)、胰蛋白酶(4000 U/g)、動物蛋白酶(4000 U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g) 重慶市全新祥盛生物制藥有限公司;卵清蛋白(43000 Da)、細(xì)胞色素C(12384 Da)、抑肽酶(6512 Da)、維生素B12(1355 Da) 美國Sigma-Aldrich公司;其他試劑 均為分析純。

s220型pH計(jì) 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;3K15型臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;TLE104E型分析天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;DKZ-3B型水浴振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;K9840型凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;LC-20A型高效液相色譜儀 日本島津制作所;L8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五種蛋白酶水解制備牡蠣酶解產(chǎn)物 牡蠣酶解產(chǎn)物制備參照姚玉靜等[9]的方法略有修改。凍藏牡蠣原料置于室溫解凍后,根據(jù)原料的質(zhì)量按照1∶1的比例加入相應(yīng)重量的蒸餾水,攪拌均勻。依據(jù)表1各種蛋白酶的酶解條件進(jìn)行水解,用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液或0.05 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至各種酶最適pH。酶解結(jié)束后沸水浴20 min滅酶,8000 r/min離心20 min,取上清液即為酶解產(chǎn)物,-18 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 五種蛋白酶水解條件Table 1 The hydrolysis conditions of five proteases

1.2.2 水解度測定 氨基酸態(tài)氮含量依據(jù)甲醛滴定法測定[10]?？偟恳勒铡禛B 5009.5-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定 第一法 凱氏定氮法》。水解度(degree of hydrolysis,DH)按下列公式計(jì)算:DH(%)=(酶解液中氨基酸態(tài)氮含量-原料中氨基酸態(tài)氮含量)/原料中總氮含量×100

1.2.3 感官評價(jià) 參照姚玉靜等[10]的方法進(jìn)行感官評價(jià)。選取7名經(jīng)過篩選和滋味培訓(xùn)的食品專業(yè)學(xué)生作為感官評定員(3名男性、4名女性)。滋味標(biāo)準(zhǔn)品分別是鮮味(0.2%味精),甜味(1%蔗糖),咸味(0.35%食用鹽),酸味(0.04%檸檬酸),苦味(0.02 g/L鹽酸奎寧)。使用5點(diǎn)線性坐標(biāo),將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,最高濃度為10分,最低濃度為2分,每稀釋1個(gè)梯度,感官分值降低2分。酶解液稀釋3倍,采用感官定量分析對酶解產(chǎn)物進(jìn)行感官評價(jià)。

1.2.4 肽分子量分布測定 參照張杰等[11]的方法略有修改。將酶解產(chǎn)物稀釋至蛋白濃度為1 mg/mL,經(jīng)過0.22 μm微濾膜,使用高效液相色譜測定樣液中肽分子量分布。色譜柱:TSk gel G2000 SWxL(300 mm×7.8 mm,5 μm),檢測波長:220 nm,柱溫箱溫度:30 ℃,流動相:超純水∶乙腈∶三氟乙酸=55∶45∶0.1(體積比),流速:1 mL/min,進(jìn)樣量:10 μL。將4種肽標(biāo)準(zhǔn)品(卵清蛋白、細(xì)胞色素C、抑肽酶、維生素B12)配制成1 mg/mL溶液,進(jìn)行高效液相色譜洗脫。根據(jù)出峰時(shí)間和分子量大小的對數(shù)值作肽分子量標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為y=-0.3109x+6.9925(R2=0.9932),劃分出>10、5～10、3～5、1～3和<1 kDa五個(gè)分子量段對應(yīng)的保留時(shí)間段,對色譜曲線進(jìn)行保留時(shí)間積分求得酶解液中不同分子量段。

1.2.5 游離氨基酸組成測定 根據(jù)《GB 5009.124-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》進(jìn)行酶解產(chǎn)物氨基酸組成測定。

1.2.6 游離氨基酸滋味貢獻(xiàn)評價(jià) 采用呈味強(qiáng)度值(Taste Activity Value,TAV)評價(jià)單個(gè)游離氨基酸對酶解產(chǎn)物滋味的貢獻(xiàn),即樣品中各呈味物質(zhì)的含量與該物質(zhì)味道閾值之比[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次。采用EXCEL 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種酶解產(chǎn)物的水解度

由圖1可知,胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解牡蠣所得酶解產(chǎn)物水解度分別為 30.05%、30.57%、30.19%、28.68%和29.00%,均在30%左右,表明5種蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度基本一致?？蔀楹罄m(xù)酶解產(chǎn)物感官評價(jià)、肽分子量和游離氨基酸的分析提供水解度一致的條件,規(guī)避水解度的影響。

圖1 五種酶解產(chǎn)物的水解度Fig.1 Degree of hydrolysis of five hydrolysates

2.2 五種酶解產(chǎn)物的感官評價(jià)

呈味基料具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富、口感飽滿和特征風(fēng)味濃郁的特點(diǎn)[13]。牡蠣酶解產(chǎn)物作為應(yīng)用前景廣闊的呈味基料,必須具有較佳的感官品質(zhì)才能有廣泛的應(yīng)用。鮮味和甜味可賦予較佳的感官品質(zhì),而苦味一般認(rèn)為滋味較差。由圖2可知,胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解產(chǎn)物鮮味評分分別為10.0、9.3、9.7、9.3 和10.0,表明5種酶解產(chǎn)物均具有較強(qiáng)的鮮味。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解產(chǎn)物甜味評分分別為8.7、8.0、8.7和9.3。表明胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的甜味,而中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的甜味評分最低。五種酶解產(chǎn)物苦味評分均較低,其中胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物苦味評分均為2.0。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味評分分別為3.7、8.7、2.0、7.3和9.7,在五種酶解產(chǎn)物中整體感官評價(jià)較佳,呈現(xiàn)出貝類風(fēng)味突出,強(qiáng)烈鮮味,甜味明顯,咸味濃厚,弱酸味和苦味。侯清娥[8]在研究中也發(fā)現(xiàn)牡蠣經(jīng)過不同蛋白酶酶解后,酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出較強(qiáng)的鮮味。

圖2 五種酶解產(chǎn)物的滋味特性雷達(dá)圖Fig.2 Taste characteristic radar map of five hydrolysates

2.3 五種酶解產(chǎn)物的肽分子量分布

小分子肽對酶解產(chǎn)物滋味有重要影響。通常認(rèn)為分子量<5 kDa的肽可能會顯現(xiàn)出酸、甜、苦、咸和鮮味,而分子量>5 kDa的肽無滋味[14]。由圖3可知,五種酶解產(chǎn)物肽分子量分布呈現(xiàn)較大的差異。分子量為3～5 kDa肽比例從大到小是堿性蛋白酶(26.62%)、中性蛋白酶(23.41%)、動物蛋白酶(23.24%)、胰蛋白酶(22.74%)和風(fēng)味蛋白酶(16.34%)。分子量為1～3 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(32.54%)、動物蛋白酶(31.67%)、中性蛋白酶(30.70%)、風(fēng)味蛋白酶(29.50%)和堿性蛋白酶(25.33%)。分子量<1 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(19.71%)、動物蛋白酶(18.53%)、中性蛋白酶(17.42%)、堿性蛋白酶(16.50%)和風(fēng)味蛋白酶(12.93%)。綜合分析,分子量<5 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(74.99%)、動物蛋白酶(73.44%)、中性蛋白酶(71.53%)、堿性蛋白酶(68.46%)和風(fēng)味蛋白酶(58.77%)。表明在水解度一致的情況下,蛋白酶的種類對牡蠣酶解產(chǎn)物肽分子量分布有較大影響。然而,感官評價(jià)中滋味最佳的是堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物,其分子量<5 kDa肽比例在五種酶解產(chǎn)物中不是最大。表明酶解產(chǎn)物的滋味特性不僅與肽比例有關(guān),可能與肽組成和肽含量有密切關(guān)系。后續(xù)需要深入研究牡蠣堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物良好滋味與小分子肽的關(guān)聯(lián)。

圖3 五種酶解產(chǎn)物的肽分子量分布范圍Fig.3 The range of peptide molecularweight in five hydrolysates

2.4 五種酶解產(chǎn)物的游離氨基酸組成及評價(jià)

表2 五種酶解產(chǎn)物的氨基酸組成Table 2 Free amino acids composition of five hydrolysates

游離氨基酸具有增鮮和提高機(jī)體免疫力等作用[15]。游離氨基酸也是肉類及其酶解產(chǎn)物重要的滋味呈味和香味前體物質(zhì)[16]。由表2可知,五種酶解產(chǎn)物均含有16種氨基酸,其中含有7種必需氨基酸。五種酶解產(chǎn)物在各種氨基酸含量、游離氨基酸總量和必需氨基酸總量均存在較大差異。五種酶解產(chǎn)物中游離氨基酸百分比均呈現(xiàn)出谷氨酸百分比最高、組氨酸百分比最低的特點(diǎn)。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中谷氨酸百分比分別為9.61%、9.86%、10.48%、12.04%和10.73%。

游離氨基酸總量從高到低為胰蛋白酶(22.816 mg/g)、中性蛋白酶(20.775 mg/g)、風(fēng)味蛋白酶(20.530 mg/g)、動物蛋白酶(16.287 mg/g)、堿性蛋白酶(16.232 mg/g)。必需氨基酸總量從高到低為中性蛋白酶(7.806 mg/g)、胰蛋白酶(7.691 mg/g)、風(fēng)味蛋白酶(7.466 mg/g)、堿性蛋白酶(5.979 mg/g)、動物蛋白酶(5.410 mg/g)。5種酶解產(chǎn)物中必需氨基酸百分比在33.22%～37.57%之間,中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中必需氨基酸百分比最高為37.57%,其次為堿性蛋白酶(36.83%)。

游離氨基酸是酶解產(chǎn)物滋味的重要來源?？梢源笾掳寻被岱譃轷r味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸)、甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸)、苦味氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、色氨酸)、芳香族氨基酸(半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)[17]。通常認(rèn)為鮮味氨基酸和甜味氨基酸引起愉快的滋味感受,苦味氨基酸和芳香族氨基酸引起不愉悅的滋味感受[12]。由表2可知,五種酶解產(chǎn)物游離氨基酸含有3種鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸)、6種甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸)、5種苦味氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸)和2種芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)。由圖4可知,五種酶解產(chǎn)物游離氨基酸中鮮味氨基酸百分比從高到低分別是風(fēng)味蛋白酶(23.82%)、中性蛋白酶(23.74%)、動物蛋白酶(21.83%)、胰蛋白酶(21.71%)、堿性蛋白酶(20.77%)。五種酶解產(chǎn)物游離氨基酸中甜味氨基酸百分比從高到低分別是風(fēng)味蛋白酶(37.70%)、堿性蛋白酶(35.14%)、中性蛋白酶(35.03%)、胰蛋白酶(33.90%)、動物蛋白酶(33.81%)。五種酶解產(chǎn)物游離氨基酸中鮮味氨基酸+甜味氨基酸均已超過50%。

圖4 五種酶解產(chǎn)物呈味氨基酸百分比Fig.4 The percentage of flavor amino acids in five hydrolysates

然而,不同氨基酸的味覺閾值不同,含量高的呈味氨基酸并不一定對樣品的滋味貢獻(xiàn)大。目前,通常采用呈味強(qiáng)度值法(TAV)評價(jià)物質(zhì)對樣品滋味貢獻(xiàn)的大小,當(dāng)TAV 大于1 時(shí),該物質(zhì)對樣品呈味有重要貢獻(xiàn),并且數(shù)值越大,貢獻(xiàn)越大。而小于1時(shí),該物質(zhì)對樣品呈味貢獻(xiàn)不大,呈味作用不顯著[18]。

表3 五種酶解產(chǎn)物游離氨基酸的TAVTable 3 Taste activity values of free amino acids in five hydrolysates

由表3可知,胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸數(shù)量分別為10、8、8、9和11種。胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、5種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.06～7.31之間。動物蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、4種苦味氨基酸,TAV值在1.02～5.36之間。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、3種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.22～5.67之間。中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸包括2種鮮味氨基酸、2種甜味氨基酸、4種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.22～8.34之間。風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸包括3種鮮味氨基酸、3種甜味氨基酸、4種苦味氨基酸和1種無味氨基酸,TAV值在1.03～7.34之間。5種蛋白酶酶解產(chǎn)物中,TVA值最大的氨基酸均是谷氨酸。表明谷氨酸是五種酶解產(chǎn)物游離氨基酸中最主要的呈鮮物質(zhì),并且是牡蠣酶解產(chǎn)物鮮味滋味的重要提供者。賴氨酸是必需氨基酸,也是重要的呈鮮氨基酸。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中賴氨酸TAV值分別為4.01、2.80、2.40、3.00和3.19。在5種酶解產(chǎn)物中,風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物TAV大于1的游離氨基酸數(shù)量最多,其中含有的鮮味氨基酸數(shù)量也最多。然而,感官評價(jià)最佳的是堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物。表明,游離氨基酸是滋味的重要貢獻(xiàn)者,但不是唯一的影響因素。

3 結(jié)論

本研究采用5種典型的蛋白酶分別對牡蠣進(jìn)行水解,在水解度一致的情況下,探究胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對酶解產(chǎn)物感官、肽分子量和游離氨基酸的影響。結(jié)果顯示,五種酶解產(chǎn)物均具有較強(qiáng)的鮮味。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物在五種酶解產(chǎn)物中整體感官評價(jià)最佳。五種酶解產(chǎn)物分子量<5 kDa的肽比例均超過50%。分子量<5 kDa肽比例從大到小是胰蛋白酶(74.99%)、動物蛋白酶(73.44%)、中性蛋白酶(71.53%)、堿性蛋白酶(68.46%)和風(fēng)味蛋白酶(58.77%)。五種酶解產(chǎn)物中游離氨基酸百分比均呈現(xiàn)出谷氨酸百分比最高、組氨酸百分比最低的特點(diǎn)。游離氨基酸總量從高到低為胰蛋白酶(22.816 mg/g)、中性蛋白酶(20.775 mg/g)、風(fēng)味蛋白酶(20.530 mg/g)、動物蛋白酶(16.287 mg/g)、堿性蛋白酶(16.232 mg/g)。胰蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物中TAV大于1的游離氨基酸數(shù)量分別為10、8、8、9和11種。5種蛋白酶酶解產(chǎn)物中,TVA值最大的氨基酸均是谷氨酸。牡蠣酶解產(chǎn)物具有復(fù)雜的滋味特性,下一步研究應(yīng)針對小分子肽的呈味特性,對其進(jìn)行分離鑒定,以剖析牡蠣酶解產(chǎn)物的滋味特征,為牡蠣酶解產(chǎn)物工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。