邵 琿，胡 志，宋 強(qiáng)，閆丹丹，楊龍寶

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)構(gòu)性心臟病科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710004)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型，是全球范圍內(nèi)最為常見的一種惡性腫瘤。隨著近年來分子生物學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，識別特定的分子生物標(biāo)記物對肝癌的診治、預(yù)后有著重要的臨床意義[1]。目前多數(shù)研究重點(diǎn)放在針對肝癌的分子發(fā)病機(jī)制基礎(chǔ)上，試圖尋找新的腫瘤標(biāo)記物和潛在靶向治療點(diǎn)[2]。微染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein，MCM)家族是一個新近報(bào)道的基因家族，在真核生物基因組復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。其家族成員包括MCM2～7，其中MCM6是由Holthoff等在突變酵母中發(fā)現(xiàn)并分離提取出來的。諸多研究報(bào)道，MCM蛋白在癌癥進(jìn)展及預(yù)后方面發(fā)揮重要作用，其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[3～6]。有研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者血漿MCM6 mRNA和蛋白水平與血管浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，MCM6被認(rèn)為是特異性細(xì)胞增殖相關(guān)因子，血清MCM6可作為肝癌的一種獨(dú)立生物標(biāo)記物[7]。本研究評估了MCM6在HCC中的表達(dá)及與HCC臨床特征的關(guān)系，探討了MCM6在HCC患者中的潛在預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料2008年1～12月癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中376例HCC患者的臨床資料，其中MCM6表達(dá)374例，癌旁組織50例。

1.2 方法收集HCC患者的基因表達(dá)譜和臨床資料，如年齡、性別、組織學(xué)分級、病理分期及總生存率等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R軟件[8]進(jìn)行。采用Wilcoxon符號秩和、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)及Logistic回歸分析MCM6表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法分析MCM6表達(dá)水平與患者總生存率(OS)之間的相關(guān)性。多變量Cox分析用于驗(yàn)證MCM6表達(dá)與生存率以及其他臨床特征之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床參數(shù)376例HCC患者的臨床資料，包括年齡、性別、病理分期、組織學(xué)分級、總生存率及預(yù)后等。見表1。

表1 HCC患者的臨床參數(shù)

2.2 MCM6在HCC中的表達(dá)HCC中MCM6的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)。MCM6在50例HCC中的表達(dá)水平亦顯著高于配對的癌旁組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 HCC中的MCM6明顯高于癌旁組織 a.癌組織與癌旁組織；b.癌組織與配對的癌旁組織

2.3 HCC患者中MCM6表達(dá)的影響因素Logistic回歸分析顯示，MCM6在<60歲HCC中的高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)明顯高于≥60歲HCC患者(P<0.05)，且隨著組織學(xué)分級(G3 vs G1，G4 vs G1)、病理分期(III+IV級 vs I+II級)、T分期(T2 vs T1，T3 vs T1)的分級逐漸增高，MCM6在HCC中的高表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)亦愈高(P均<0.05)，見表2。

表2 HCC患者中MCM6表達(dá)的影響因素分析

2.4 MCM6表達(dá)對HCC患者預(yù)后的影響根據(jù)HCC患者中MCM6表達(dá)值的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。缺乏完整臨床資料的患者數(shù)據(jù)不被納入分析。Kaplan-Meier生存分析表明，與MCM6低表達(dá)組相比，MCM6高表達(dá)組的HCC患者生存期限明顯較差(P<0.05)，見圖2。多因素cox回歸分析表明，僅有MCM6表達(dá)與OS明顯獨(dú)立相關(guān)(P<0.05)，見表3。

圖2 MCM6不同表達(dá)水平的HCC患者的生存曲線

表3 HCC患者中MCM6表達(dá)與患者總生存率關(guān)系的多因素cox回歸分析

3 討論

HCC是全球范圍內(nèi)普遍存在的一種惡性腫瘤，因其臨床癥狀出現(xiàn)較晚，癥狀出現(xiàn)時(shí)多數(shù)已處于中晚期，因而易錯過最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，預(yù)后較差。目前其治療手段仍然較局限，治療效果不甚理想，復(fù)發(fā)率和死亡率較高，因此對于肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療就顯得尤為重要，而肝癌的治療對我們來說仍是一個巨大的挑戰(zhàn)[2]。肝癌的發(fā)生發(fā)展過程十分復(fù)雜，目前尚沒有完全統(tǒng)一明確的發(fā)病機(jī)制[9]。由于目前分子生物技術(shù)、基因組學(xué)工程等發(fā)展迅速，人們對肝癌的研究也逐漸深入，眾多學(xué)者開始致力于篩選理想的肝癌標(biāo)記物，試圖從分子標(biāo)記物著手，希冀發(fā)現(xiàn)較為特異的肝癌標(biāo)記物，從而為肝癌的診治提供有利幫助。目前在肝癌的研究領(lǐng)域里，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種肝癌分子標(biāo)記物能夠較為特異的診斷肝癌。當(dāng)前用于篩查HCC的常用方法是血清α-甲胎蛋白(AFP)檢測和肝臟成像，例如超聲和計(jì)算機(jī)斷層掃描，但由于AFP在某些組織學(xué)類型肝癌和部分小肝癌患者中可能表現(xiàn)出陰性結(jié)果，因此迫切需要開發(fā)新的生物標(biāo)記物以對部分類型肝癌進(jìn)行早期診斷和作為AFP陰性肝癌的補(bǔ)充篩查手段。有研究發(fā)現(xiàn)，臨床最常見的肝癌腫瘤標(biāo)志物 AFP蛋白和MCM6蛋白在區(qū)分總HCC組和非HCC組方面的敏感性分別為78.7%、67.2%，而在特異性方面分別為57.6%、89.8%。在全部HCC患者中，MCM6 mRNA和蛋白與AFP蛋白水平無顯著相關(guān)性(P>0.05)[7]。因此，為了能夠在肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷及靶向治療方面有所突破，尋求特異性和敏感性更高的肝癌分子生物標(biāo)記物迫在眉睫。

MCM6是MCM基因家族成員之一，而MCMs在DNA復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用[10]。有研究報(bào)道MCMs只在增殖細(xì)胞和具有增殖潛能的細(xì)胞和中表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞[11，12]。MCMs是細(xì)胞增殖的候選標(biāo)記物，MCMs水平升高提示惡性細(xì)胞增殖。越來越多的證據(jù)表明MCMs可以預(yù)測腫瘤進(jìn)展和預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)MCM6在乳腺癌中高表達(dá)，并可作為其臨床診斷及預(yù)后的一個很有意義的生物學(xué)指標(biāo)[13]。在霍奇金淋巴瘤病人的活檢淋巴結(jié)中，MCM6高表達(dá)是淋巴瘤細(xì)胞的一個顯著特點(diǎn)[13]。同時(shí)，MCM4、MCM5、MCM6、MCM10和RECQL4 mRNA的過度表達(dá)被認(rèn)為是宮頸癌預(yù)后不良的指標(biāo)[5]。MCM2被證明是食管癌和膀胱癌的生物標(biāo)記物[14，15]?？傊?，近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，MCM6在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如胃癌、子宮內(nèi)膜癌、腦膠質(zhì)瘤等，MCM6表達(dá)增加與腫瘤患者的低生存率明顯相關(guān)[7，9，10]。MCMs除了作為細(xì)胞增殖標(biāo)記外，MCM蛋白的診斷潛力也一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究[16]通過免疫染色結(jié)果和臨床實(shí)踐證實(shí)MCM陽性細(xì)胞大多分布在惡性和癌前上皮細(xì)胞的表面，這意味著臨床細(xì)胞學(xué)標(biāo)本容易獲取和復(fù)制。因此，MCMs在癌癥篩查和診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。有研究證實(shí)，與非腫瘤標(biāo)本相比，MCM2、MCM6和MCM7蛋白在HCC中的表達(dá)水平顯著增高[4]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MCM2-7蛋白可作為HCC的敏感診斷標(biāo)志物，其中生存分析和聯(lián)合效應(yīng)分析表明，MCM2聯(lián)合MCM6可共同作為HCC的預(yù)后指標(biāo)[17]。通過PCR和平行免疫染色進(jìn)一步證實(shí)，MCM6在HCC中的診斷和預(yù)后優(yōu)于MCM2和其他MCM[4，7]。MCMs水平的升高既有助于腫瘤的早期診斷，又能夠預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)[4]。以上這些研究足夠說明MCM6在癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測預(yù)后中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在本文中，我們試圖確定MCM6表達(dá)在HCC進(jìn)展中的作用，特別是作為HCC預(yù)后因素的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)[18，19]，肝癌高發(fā)年齡段多集中在50～60歲，本研究將60歲設(shè)為年齡節(jié)點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCM6在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，其高表達(dá)與發(fā)病年齡、組織學(xué)分級、病理分期、T分期有關(guān)，即MCM6在<60歲患者中的表達(dá)明顯高于≥60歲患者(P<0.05)，隨著組織學(xué)分級(G3vsG1，G4vsG1)、病理分期(III+IV級vsI+II級)、T分期(T2vsT1，T3vsT1)的分級逐漸加重，MCM6表達(dá)亦隨之增加(均P<0.05)。這些結(jié)果表明，隨著MCM6表達(dá)的增加，HCC患者病情有可能進(jìn)展到更晚期，腫瘤浸潤范圍可能更廣，惡性程度更高。其次，Kaplan-Meier生存分析顯示，與MCM6低表達(dá)組相比，MCM6高表達(dá)組的OS較差，進(jìn)一步的多因素分析表明MCM6的表達(dá)是HCC的一個獨(dú)立預(yù)后因素，與既往研究結(jié)果[4]一致，即MCM6獨(dú)立預(yù)測了HCC患者的較差生存率，以及血清MCM6水平被報(bào)道為HCC的獨(dú)立生物標(biāo)志物，特別是在AFP陰性和小肝癌患者中。

如上所述，MCM6是一種HCC較優(yōu)的診斷和預(yù)后指標(biāo)，可作為肝癌患者一種新型生物標(biāo)志物，同時(shí)是常見腫瘤標(biāo)志物AFP篩查HCC的補(bǔ)充手段，為以后肝癌患者的臨床診治工作提供了新的選擇和診療思路。當(dāng)然，我們的研究也有一些局限性。首先，我們在本研究中分析的數(shù)據(jù)是從公共數(shù)據(jù)庫中提取出來的，這些數(shù)據(jù)庫沒有經(jīng)過驗(yàn)證。其次，MCM6調(diào)控HCC發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，推測其可能通過改變細(xì)胞增殖而引起肝癌的發(fā)生發(fā)展，當(dāng)然同時(shí)需要更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來證實(shí)MCM6在HCC患者中的診斷和預(yù)后價(jià)值。

綜上，本研究顯示MCM6在HCC中高表達(dá)，參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，是預(yù)測HCC患者OS很有價(jià)值的預(yù)后因素，可作為HCC的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志物。但需要更多的研究來驗(yàn)證本研究的發(fā)現(xiàn)。