孫光源 郭圣超 武雪亮 薛軍 屈明 郭飛 韓磊 韓潔

[摘要] 目的 探討UBQLN-1（泛素-1）和人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）在直腸癌組織中的表達(dá)和臨床意義。方法 選取2017年6月—2019年6月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除的85例直腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）和免疫組化法檢測(cè)UBQLN-1及RUNX3 mRNA與蛋白水平，分析其與腫瘤臨床病理特征間的關(guān)系及二者表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織，RUNX3 mRNA的表達(dá)水平低于癌旁正常組織，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)（P < 0.01）。直腸癌組織中UBQLN-1陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，RUNX3陽性表達(dá)率低于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。直腸癌組織中UBQLN-1與RUNX3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.225，P = 0.038）。 結(jié)論 UBQLN-1和RUNX3在直腸癌組織中的異常表達(dá)與其發(fā)生發(fā)展、演進(jìn)密切相關(guān)，且二者呈明顯負(fù)相關(guān)，可作為直腸癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的潛在分子生物學(xué)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 泛素-1;人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3;直腸癌;臨床意義

[中圖分類號(hào)] R735.3+7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）09（c）-0028-05

Expression of UBQLN-1 and RUNX3 in rectal cancer tissues and their clinical significance

SUN Guangyuan1? ?GUO Shengchao2? ?WU Xueliang1? ?XUE Jun1? ?QU Ming1? ?GUO Fei1? ?HAN Lei1? ?HAN Jie3

1.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou? ?075061， China; 2.Graduate School， Hebei North University， Hebei Province， Zhangjiakou? ?075061， China; 3.Department of Ophtalmology， the Fourth Hospital of Zhangjiakou， Hebei Province， Zhangjiakou? ?075061， China

[Abstract] Objective To explore the expression of UBQLN-1 and RUNX3 in rectal cancer tissues and clinical significance. Methods From June 2017 to June 2019， 85 cases of rectal cancer tissues and adjacent normal tissues were selected from the First Affiliated Hospital of Hebei North University were selected. The mRNA and protein levels of UBQLN-1 and RUNX3 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemistry and the relationship between UBQLN-1， RUNX3 and the clinicopathological characteristics of tumors and the correlation between their expressions were analyzed. Results The expression of UBQLN-1 mRNA in rectal cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues; and the expression of RUNX3 mRNA in rectal cancer tissues was lower than that in adjacent normal tissues，and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The positive expression rate of UBQLN-1 in rectal cancer tissues was higher than that in adjacent normal tissues and the positive expression rate of RUNX3 was lower than that of adjacent normal tissues， with highly statistically significant differences （P < 0.01）. UBQLN-1 was negatively correlated with RUNX3 expression in rectal cancer tissues（r = -0.225， P = 0.038）. Conclusion The abnormal expressions of UBQLN-1 and RUNX3 in the rectal cancer tissues are closely related to their development and evolution， and rectal cancer tissues and adjacent normal tissues are significantly negatively correlated， which can be used as potential molecular biological indicators for the diagnosis， treatment and prognosis assessment of rectal cancer.

[Key words] Ubiquitin-1; Human RUNt-related transcription factor 3; Rectal cancer; Clinical significance

2018年全球癌癥流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫顯示[1]，全球結(jié)直腸癌新增病例180萬例，占新發(fā)癌癥病例總數(shù)的10.2%，居惡性腫瘤第三位，結(jié)直腸癌死亡病例達(dá)80萬，占癌癥死亡總數(shù)的9.2%，惡性腫瘤排名第二。2015年我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例約為38.80萬例，發(fā)病率位居第三位，死亡病例約為18.7萬例，死亡率位居第五位，防控診療形勢(shì)不容樂觀[2]

泛素-1（UBQLN-1）屬于泛素樣蛋白一族，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解中起重要作用。UBQLN-1功能的失活可誘導(dǎo)人類多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程，如阿爾茨海默病和亨廷頓病等[3-5]。此外，最新研究顯示[6]，UBQLN-1與人類乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞癌等多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，但UBQLN-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及相應(yīng)的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（RUNX3）是目前研究較熱的一種抑癌基因，本研究之前已證實(shí)RUNX3蛋白陽性表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中明顯低于正常組織[7]，但聯(lián)合UBQLN1和RUNX3與直腸腫瘤的相關(guān)性及其預(yù)后的研究尚未見報(bào)道。

本研究通過對(duì)直腸癌組織行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法和免疫組化SP法檢測(cè)，旨在探討UBQLN-1和RUNX3在直腸癌中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系，為直腸癌的早期篩查診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)提供潛在可靠的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月—2019年6月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）行手術(shù)切除的85例直腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①相關(guān)檢查診斷明確為直腸癌;②肝腎功能正常;③首次治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不配合治療者;②臨床資料不完整者;③合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤及并發(fā)癥者。其中男59例，女26例;年齡30～72歲，平均（51.2±7.7）歲;癌胚抗原（CEA）≤5 μg/L 74例，CEA>5 μg/L 11例;糖類抗原（CA）199≤37 U/mL 79例，CA199>37 U/mL 6例;cT分期T1～2、T3～4分別為32、53例;cN分期N-和N+分別為50、35例;臨床病理分期[國(guó)際抗癌聯(lián)盟UICC結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)（2018年第八版）[8]]cTNM分期：Ⅱ期50例，Ⅲ期35例;分化程度：低分化17例，中分化66例，高分化2例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑? 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于中國(guó)大連TaKaRa公司（貨號(hào)：639505）;引物購(gòu)于中國(guó)廣州鼎國(guó)生物科技有限公司;RIPA試劑購(gòu)于上?；巧锟萍加邢薰荆ㄘ浱?hào)：PP1901）;鼠抗UBQLN-1（貨號(hào)：ab128011）、RUNX3（貨號(hào)：ab224641）單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;免疫組化試劑盒（貨號(hào)：GK600705）、DAB顯色劑（貨號(hào)：GK347010）購(gòu)于上海Gene Tech公司。

1.2.2 RT-PCR法檢測(cè)直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1 mRNA和RUNX3 mRNA的表達(dá)? 取直腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織100 mg，徹底勻漿后按Trizol一步法提取總RNA，測(cè)定RNA濃度;設(shè)計(jì)UBQLN-1上游引物：5′-GGAGACGGTCATCCCTGTAGAT-3′，下游引物：5′-GCTACACTGTACTGGGTCTTTTCCA-3′;RUNX3上游引物：5′-CTCTGCTCTGTCAGCTTCGG-3′，下游引物：5′-AGAATTTGGATTCCCGGTCCC-3′;GAPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′;反應(yīng)體系：1×PCR Buffer 2.5 μL，cDNA模板2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶1.25 μL，上、下游引物各1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，加DEPC-H2O至總體積25 μL。根據(jù)試劑盒說明書操作進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂電泳后用Labworks 4.5圖像系統(tǒng)分析。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1和RUNX3蛋白的表達(dá)? 分別取入組患者手術(shù)后的直腸癌組織和癌旁正常組織，4%甲醛溶液固定（固定液用量為組織的10倍），石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度3 μm/張）。采用免疫組織化學(xué)染色SP法對(duì)直腸癌組織和癌旁正常組織中UBQLN-1和RUNX3的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。將包埋好的石蠟依次進(jìn)行切片、脫蠟和水化，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，3 min/次，抗原修復(fù)自然冷卻至室溫，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗，37℃孵育60 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，DAB顯色，室溫孵育10 min，復(fù)染，分化、返藍(lán)，脫水、封片，40倍顯微鏡鏡檢并采圖。

UBQLN-1蛋白陽性表達(dá)為棕黃色或棕褐色，主要位于細(xì)胞質(zhì)中;RUNX3蛋白在結(jié)直腸癌中陽性表達(dá)為深棕褐色或棕黃色，主要位于細(xì)胞核中，而在正常組織中呈棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞漿中，且染色深度遠(yuǎn)小于細(xì)胞核。兩者的染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]的標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分;根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分為：無染色0分，弱染色1分，中等染色2分，強(qiáng)染色3分;兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終的評(píng)分，總積分≤3分為陰性，>3分為陽性[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1 mRNA和RUNX3 mRNA表達(dá)比較

直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA表達(dá)水平（1.28±0.07）高于癌旁正常組織（0.24±0.02），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 131.706，P = 0.000）;直腸癌組織中RUNX3 mRNA的表達(dá)水平（0.35±0.04）低于癌旁正常組織（1.20±0.06），差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)（t = 108.674，P = 0.000）。見圖1。

2.2 直腸癌組織和癌旁正常組織UBQLN-1和RUNX3蛋白表達(dá)比較

直腸癌組織中UBQLN-1陽性表達(dá)率為69.41%（59/85），高于癌旁正常組織的21.18%（18/85），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.906，P = 0.000）;直腸癌組中RUNX3陽性表達(dá)率為40.00%（34/85），低于癌旁正常組織的77.65%（66/85），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=24.869，P = 0.000）。見圖2（封三）。

2.3 直腸癌組織中UBQLN-1和RUNX3表達(dá)與患者一般資料及病理特征的關(guān)系

UBQLN-1和RUNX3與cT分期、cN分期和cTNM分期及分化程度密切相關(guān)（P < 0.05）。見表1。

2.4 直腸癌組織中UBQLN-1與RUNX3表達(dá)的相關(guān)性

直腸癌組織中UBQLN-1與RUNX3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.225，P = 0.038）。

3 討論

UBQLN-1屬于泛素蛋白家族中的核小體表面蛋白，由11個(gè)外顯子組成，位于人類染色體9q22，具有高度保守性，包含N端的UBL結(jié)構(gòu)域，它介導(dǎo)泛素與蛋白酶體19S亞基的S5a組分的泛素受體以及C端的Uba相互作用。提示UBQLN-1通過連接泛素化機(jī)制和蛋白酶體調(diào)節(jié)蛋白酶體的降解[10-11]。UBQLN-1在不同的蛋白質(zhì)降解機(jī)制和途徑中發(fā)揮重要作用，包括泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ERAD）途徑。通過與蛋白酶體的多泛素鏈結(jié)合以及與蛋白酶體的亞單位相互作用（通過泛素樣結(jié)構(gòu)域）介導(dǎo)蛋白酶體靶向錯(cuò)誤折疊或積累的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解[12-13];通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白UBXN4、VCp和HERPUD1的相互作用，在ERAD途徑中發(fā)揮作用，并可能在多泛素化的ERAD底物和蛋白酶體之間形成聯(lián)系;UBQLN-1是自噬相關(guān)蛋白Lc3從胞液形式Lc3-Ⅰ成熟為膜結(jié)合型Lc3-Ⅱ所必需的，并可能通過介導(dǎo)自噬小體-溶酶體融合幫助自噬小體成熟為自溶酶體[14]。通過自噬途徑降低TICAM 1的豐度，對(duì)TICAM 1/TRIF依賴的Toll樣受體信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。

RUNX3基因定位于人類染色體1p36，全長(zhǎng)約為67 kb，其表達(dá)產(chǎn)物RUNX3蛋白是一種包含415個(gè)氨基酸殘基的異二聚體，該基因的沉默、失活導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[15-16]。研究證實(shí)[17-20]，RUNX3主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路來抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本團(tuán)隊(duì)前期已證實(shí)RUNX3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于結(jié)直腸腺瘤和正常組織，因而RUNX3的失活在結(jié)直腸癌變的過程中發(fā)揮重要作用[21-25]。此外，F(xiàn)eng等[26]應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染方法設(shè)置直腸癌HRC-9698細(xì)胞株的RUNX3過表達(dá)組，空白質(zhì)粒組，陰性對(duì)照組和空白組，侵襲實(shí)驗(yàn)顯示RUNX3基因在體外的過度表達(dá)能夠抑制直腸癌細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而為直腸癌的分子靶向治療提供了新思路和新的治療靶標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，UBQLN-1和RUNX3與cT分期、cN分期和cTNM分期及分化程度密切相關(guān)（P < 0.05），且UBQLN-1與RUNX3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.225，P = 0.038）。目前，尚未有關(guān)于二者對(duì)術(shù)后患者預(yù)后方面的文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上，相較于正常組織，直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA與蛋白高表達(dá)，RUNX3 mRNA與蛋白低表達(dá)，隨著癌組織分化程度變低、cTNM分期變晚，UBQLN-1的陽性表達(dá)率升高，而RUNX3的陽性表達(dá)率降低，在直腸癌的發(fā)生發(fā)展中，UBQLN-1的高表達(dá)或可調(diào)控RUNX3低表達(dá)。關(guān)于UBQLN-1和RUNX3在結(jié)直腸腫瘤領(lǐng)域中的研究目前相對(duì)較少，本研究結(jié)果顯示UBQLN-1和RUNX3可作為直腸癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估的潛在分子生物學(xué)指標(biāo)，其具體作用機(jī)制及二者的相互關(guān)系尚需深入研究，這也是本課題今后的研究方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Bray F，F(xiàn)erlay J，Soerjomataram I，et al. Global cancer statistics 2018：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]. CA Cancer J Clin，2018，68：394-424.

[2]? 鄭榮壽，孫可欣，張思維，等.2015年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019，41（1）：19-28.

[3]? Li X，Zhou J，Chen H，et al. The association between the UBQLN1 polymorphism and Alzheimer′s disease risk：A systematic review [J]. Cell Mol Biol，2017，63（5）：94-96.

[4]? Yue Z，Wang S，Yan W，et al. Association of UBQ-8i polymorphism with Alzheimer′s disease in Caucasians：a meta-analysis [J]. Int J Neurosci，2015，125（6）：395-401.

[5]? Luo L，Liu Y，Tu X，et al. Decreased expression of ubiquilin 1 following neonatal hypoxia ischemic brain injury in mice [J]. Mol Med Rep，2019，19（6）：4597-4602.

[6]? Kurlawala Z，Dunaway R，Shah PP，et al. Regulation of insulin-like growth factor receptors by Ubiquilin1 [J]. Biochem J，2017，474（24）：4105-4118.

[7]? 薛軍，武雪亮，賈光輝，等.RUNX3蛋白在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].河北醫(yī)藥，2013，35（24）：3708-3709.

[8]? Weiser MR. AJCC 8th Edition：Colorectal Cancer [J]. Ann Surg Oncol，2018，25（6）：1454-1455.

[9]? Ben Brahim E，Ayari I，Jouini R，et al. Expression of epidermal growth factor receptor （EGFR） in colorectal cancer：An immunohistochemical study [J]. Arab J Gastroenterol，2018，19（3）：121-124.

[10]? Adegoke OO，Qiao F，Liu Y，et al. Overexpression of Ubiquilin-1 Alleviates Alzheimer′s Disease-Caused Cognitive and Motor Deficits and Reduces Amyloid-β Accumulation in Mice [J]. J Alzheimers Dis，2017，59（2）：575-590.

[11]? Fang X，Trexler C，Chen J，et al. Ushering in the cardiac role of Ubiquilin1 [J]. J Clin Invest，2018，128（12）：5195-5197.

[12]? Kim HT，Goldberg AL. UBL domain of Usp14 and other proteins stimulates proteasome activities and protein degradation in cellsl [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2018， 115（50）：E11642-E11650.

[13]? Liu Y，Qiao F，Wang H. Enhanced Proteostasis in Post-ischemic Stroke Mouse Brains by Ubiquilin-1 Promotes Functional Recovery [J]. Cell Mol Neurobiol，2017，37（7）：1325-1329.

[14]? Mizukami K，Abrahamson EE，Mi Z，et al. Immunohistochemical analysis of ubiquilin-1 in the human hippocampus：association with neurofibrillary tangle pathology [J]. Neuropathology，2014，34（1）：11-18.

[15]? Bangsow C，Rubins N，Glusman G，et al. The RUNX3 gene：sequence，structure and regulated expression [J]. Gene，2001，279（2）：221-232.

[16]? Coffman JA. Runx transcription factors and the developmental balance between cell proliferation and differentiation [J]. Cell Biol Int，2003，27（4）：315-324.

[17]? Lotem J，Levanon D，Negreanu V，et al. Runx3 at the interface of immunity，inflammation and cancer [J]. Biochim Biophys Acta，2015，1855（2）：131-143.

[18]? Choi SY，Park SK，Yoo HW，et al. Charged Amino Acid-rich Leucine Zipper-1（Crlz-1）as a Target of Wnt Signaling Pathway Controls Pre-B Cell Proliferation by Affecting Runx/CBFβ-targeted VpreB and λ5 Genes [J]. J Biol Chem，2016，291（29）：15008-15019.

[19]? 任約翰，蔡劍輝，陳積賢.抑癌基因Runx3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2018，26（1）：72-76.

[20]? 楊瓊嬌，許淑媛，黃曉明，等.RUNX3和Survivin在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（2）：87-89.

[21]? 薛軍，武雪亮，王立坤，等.結(jié)直腸腺癌、腺瘤、正常黏膜中RUNX3的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30（6）：605-609.

[22]? 薛軍，武雪亮，屈明，等.結(jié)直腸癌組織RUNX3和MMP-2表達(dá)與MVD相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2015， 22（24）：1884-1888.

[23]? 武雪亮，王立坤，薛軍，等.結(jié)直腸腺癌中RUNX3表達(dá)與微淋巴管密度的關(guān)系及臨床意義[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（12）：1825-1828.

[24]? 薛軍，武雪亮，王宇，等.聯(lián)合檢測(cè)runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)在結(jié)直腸腺癌中的臨床意義[J].中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志，2014，37（29）：22-25.

[25]? 薛軍，武雪亮，王立坤，等.抑癌基因RUNX3表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的關(guān)系[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014（22）：2859-2861， 2864.

[26]? Feng Y，Gao S，Gao Y，et al. Runx3 expression in rectal cancer cells and its effect on cell invasion and proliferation [J]. Oncol Lett，2019，18（3）：3290-3294.

（收稿日期：2020-06-12）