鄧春穎 李海濱 毛文靜 李世英

[摘要] 目的 觀察丁苯酞（NBP）軟膠囊對(duì)阿爾茨海默病（AD）模型大鼠海馬CA1區(qū)絲氨酸蛋白激酶-3β（GSK-3β）、p-Tau蛋白表達(dá)的影響，探討NBP治療AD的機(jī)制。 方法 將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（24只）、AD模型組（24只）、NBP治療組（24只）。采用β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）制作AD模型，假手術(shù)組注射5 μL生理鹽水。造模成功后4周，NBP治療組給予NBP與食用油混合后制成的NBP混合溶液灌胃;假手術(shù)組和AD模型組采用同等劑量的食用油進(jìn)行灌胃。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)。采用Western blot法分別于給藥后1、2、4和8周檢測(cè)海馬CA1區(qū)GSK-3β、p-Tau蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，AD模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（均P < 0.05）;與AD模型組比較，NBP治療組各時(shí)間點(diǎn)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均增加（均P < 0.05）;與假手術(shù)組同期比較，AD模型組大鼠海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與AD模型組同期比較，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與假手術(shù)組同期比較，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 NBP可通過(guò)下調(diào)GSK-3β、p-Tau蛋白的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)AD模型大鼠的腦保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 丁酚酞;阿爾茨海默病;絲氨酸蛋白激酶-3β蛋白;p-Tau蛋白

[中圖分類號(hào)] R741.02? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）09（c）-0016-04

Effects of Butylphthalide on the expression of GSK-3β and p-Tau proteins in CA1 region of hippocampal of Alzheimer′s disease rats

DENG Chunying1? ?LI haibin2? ?MAO Wenjing1? ?LI Shiying1

1.Department of Neurology， North China University of Science and Technology Affiliated Hospital， Hebei Province， Tangshan? ?063000， China; 2.Department of Cardiology， People′s Hospital of Zunhua， Hebei Province， Zunhua? ?064200， China

[Abstract] Objetive To observe the effects of Butylphthalide （NBP） on the expression of glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） protein and p-Tau protein in CA1 region of hippocampus of Alzheimer′s disease rats， and to explore the mechanism of brain protection by butylphthalide. Method Seventy-two male SD rats were randomly divided into sham operation group （24 rats）， AD model group （24 rats） and NBP treatment group （24 rats）. Aβ-amyloid 1-42 （Aβ1-42） was used to make AD model. The sham operation group was injected with 5 μL saline. Four weeks after successful modeling， NBP treatment group was given NBP mixed solution made of NBP and edible oil by gavage. The sham operation group and the AD model group were given the same dose of edible oil. Morris water maze experiment was used to compare the number of times the rats crossed the platform. Western blot was used to detect the expression of GSK-3β and p-Tau proteins in the hippocampal CA1 region at one， two， four and eight weeks after administration. Results Compared with the sham operation group， the number of rat crossing the platform at each time point in AD model group was significantly reduced （all P < 0.05）. Compared with AD model group， the number of rats crossing the platform increased at each time point in the NBP treatment group （all P < 0.05）. Compared with the sham operation group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of the AD model group were increased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the AD model group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of rats in the NBP treatment group were decreased， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the sham operation group in the same period， the relative expression levels of p-Tau and GSK-3β proteins in the hippocampal CA1 area of rats in the NBP treatment group were increased， and the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion NBP can play a protective role on the brain of AD model rats by down-regulating the expression of GSK-3β and p-Tau protein.

[Key words] Dl-3-n-Butylphthalide; Alzheimer′s disease; Glycogen synthase kinase-3β protein; p-Tau protein

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆的主要原因[1]，以進(jìn)行認(rèn)知功能障礙為特征，表現(xiàn)為記憶力減退、言語(yǔ)障礙、定向力障礙等[2]，逐漸喪失生活能力，給家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。全球癡呆癥總?cè)藬?shù)約為2400萬(wàn)，且以驚人的速度增長(zhǎng)[3]，但目前病因尚不明確[4]，尚無(wú)特效藥物預(yù)防和延緩AD的發(fā)展。AD患者腦中過(guò)度磷酸化的Tau蛋白與微管結(jié)合能力降低，其在細(xì)胞內(nèi)聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而干擾神經(jīng)元功能，并導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死[5-6]。糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）與p-Tau的形成密切相關(guān)，且參與調(diào)節(jié)Tau蛋白異常磷酸化，此激酶異常激活可導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化而產(chǎn)生的臨床癥狀[7-8]。丁苯酞（Butylphthalide，NBP）作為我國(guó)自主研發(fā)的新藥，主要用于治療缺血性腦血管病[9]，另外還能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等[10]。近年有研究顯示NBP可改善AD患者的認(rèn)知功能，但其具體機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)研究NBP對(duì)GSK-3β、p-Tau蛋白表達(dá)的影響，探討NPB治療AD的可能作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取實(shí)驗(yàn)大鼠72只，2～3月齡，健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD），體重250～280 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)為：SCXK[京]2014-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫維持在24～26℃，濕度維持在45%～55%，12 h明暗交替光照，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物操作符合科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》[11]的相關(guān)要求。

1.2 藥物、試劑及儀器

NBP軟膠囊（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司批號(hào)：121101，規(guī)格0.1 g/粒）;兔抗大鼠GSK-3β多克隆抗體（北京博奧森生物公司，批號(hào)：12456s）;兔抗大鼠p-Tau多克隆抗體（Abcam 公司，批號(hào)ab109390）;兔二步法免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺顯色液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（北京中杉生物有限公司，批號(hào)：PV-9001、K116610D、D0032-1）。石蠟組織切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司，RM2 235）;腦立體定位儀（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，ZH-藍(lán)星B/S）;Morris水迷宮（安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）;透射電子鏡（日本HITACHI公司，H-9500）;電凝儀（張家港市航天醫(yī)療電器有限公司，JGD-50B）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 ?72只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、AD模型組、NBP治療組，每組各24只。造模成功后，將AD模型組、NBP治療組實(shí)驗(yàn)大鼠再隨機(jī)分為造模后1、2、4周和8周4個(gè)亞組（每個(gè)亞組6只），假手術(shù)組隨機(jī)分成同上4個(gè)亞組。

1.3.2 模型制備 ?提前制備Aβ1-42溶液（濃度為1 μg/μL），制成凝聚狀態(tài)。通過(guò)Morris水迷宮篩選合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。腹腔注射麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），麻醉后將大鼠固定于腦立體定位儀上，選擇雙側(cè)海馬CA1區(qū)（以前囟為基準(zhǔn)點(diǎn)，向后4.5 mm，中線旁開(kāi)2 mm處），微量注射器與腦表面垂直，緩慢進(jìn)針2 mm，AD模型組及NBP治療組均緩慢注射5 μL已配備好的聚集態(tài)的Aβ1-42溶液，留針10 min后撤出針頭，封閉骨質(zhì)創(chuàng)口，縫合切口，手術(shù)區(qū)消毒。假手術(shù)組注射5 μL生理鹽水。

1.3.3 給藥方法 ?造模成功后4周進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。NBP治療組給予NBP混合溶液（NBP與食用油混合，濃度為8 mg/mL，灌胃劑量為100 g/mL），2次/d;假手術(shù)組和AD模型組亦給予灌胃處理，給予等劑量的食用油灌胃，2次/d，分別連續(xù)給藥1、2、4、8周。

1.3.4行為學(xué)測(cè)試 ?造模成功給藥后，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12]。分別觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃給藥后1、2、4周和8周穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.5 Western blot檢測(cè) ?大鼠喂養(yǎng)至各個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，腹腔注射麻醉大鼠（10%水合氯醛，350 mg/kg），冰臺(tái)斷頭取腦，分離出海馬組織。將取出的腦組織充分研磨后，置入15 mL離心管中，加組織裂解液，漿器中充分裂解40 min，4℃，60 mm，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將蛋白定量分裝后調(diào)整蛋白濃度（800 μg/mL），加等量上樣緩沖液，沸水中煮5 min后備用。檢測(cè)方法：取等量蛋白樣品（50 μg）置于10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酸銨凝膠電泳，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜膜上，室溫封閉至少2 h。分別加入相應(yīng)一抗，GSK-3β抗體（1∶500）、p-Tau抗體（1∶500），4℃冰箱孵育過(guò)夜，次日磷酸鹽緩沖液漂洗后加入羊抗兔二抗（1∶2000），37℃反應(yīng)2 h，磷酸鹽緩沖液洗膜3次，加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氯化硝基四氮唑藍(lán)顯色，顯色數(shù)分鐘，雙蒸餾水終止顯色，Image J軟件進(jìn)行灰度值測(cè)定分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用雙因素重復(fù)測(cè)量方差分析，以分組和時(shí)間作為雙因素方差分析的獨(dú)立因素，進(jìn)行Bonferroni校正。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，AD模型組及NBP治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;與AD模型組比較，NBP治療組各時(shí)間點(diǎn)大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，AD模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與AD模型組比較，NBP治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與假手術(shù)組比較，NBP治療組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)p-Tau、GSK-3β蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0. 01）。見(jiàn)表2～3、圖1。

A：各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)p-Tau蛋白表達(dá)灰度值;B：各組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)灰度值。GSK-3β：絲氨酸蛋白激酶-3β

3 討論

AD病因復(fù)雜，是一種原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以認(rèn)知功能緩慢進(jìn)行性下降為特征[13-14]，目前無(wú)特效方法治療此病。NBP是我國(guó)自主研發(fā)的用于治療缺血性腦血管病的新藥，研究顯示它除了可以改善循環(huán)、抗自由基外，還有抗氧化、抗炎、抗凋亡[15-16]，可以一定程度地改善患者認(rèn)知功能[17-18]。本研究結(jié)果顯示AD模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，采用NBP灌胃治療后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到改善，與AD模型組比較，NBP治療組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增加。

海馬屬于大腦邊緣系統(tǒng)，參與學(xué)習(xí)、記憶等過(guò)程，研究認(rèn)為海馬結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變與認(rèn)知功能密切相關(guān)[19]。結(jié)合文獻(xiàn)本研究采用Aβ1-42溶液向雙側(cè)海馬區(qū)注射制作AD模型，此模型受損部位明確，可迅速建立癡呆模型，較全面地模擬AD的全過(guò)程，包括病理改變及行為改變。在AD早期，海馬區(qū)首先受累，較公認(rèn)的假說(shuō)是該部位Aβ 淀粉樣學(xué)說(shuō)和Tau蛋白學(xué)說(shuō)[20]。Tau蛋白學(xué)說(shuō)研究中，Tau及p-Tau蛋白是研究熱點(diǎn)之一。GSK3又稱 Tau磷酸化激酶，有糖原合成激酶-3α（GSK-3α）和GSK-3β兩種形式，主要存在于大腦皮質(zhì)、海馬、浦肯野細(xì)胞等。GSK-3β是一種Tau磷酸化激酶，接受多種胞內(nèi)信號(hào)調(diào)控，參與多種生物機(jī)能，其中包括學(xué)習(xí)記憶[21-23]。它與p-Tau蛋白的形成有關(guān)。調(diào)控GSK-3β的活性主要是AKT蛋白參與，它可抑制GSK-3β活性，當(dāng)其合成障礙時(shí)，GSK-3β被激活引起Tau蛋白異常磷酸化[24]，異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成螺旋絲，最終導(dǎo)致纖維纏結(jié)。有研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)能增加GSK-3β活性，而抑制其活性，既能緩解緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，又能減少細(xì)胞凋亡[25]。本實(shí)驗(yàn)采用Western blot法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠海馬GSK-3β、p-Tau蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)GSK-3β、p-Tau蛋白均有少量表達(dá)。在AD模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均增多，4周時(shí)表達(dá)量最高，8周時(shí)稍有下降，但仍處于較高水平。而與AD模型組比較，在NBP治療組大鼠中，GSK-3β、p-Tau蛋白表達(dá)均有下降。GSK-3β、p-Tau蛋白表達(dá)的結(jié)果與行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致，NBP可通過(guò)下調(diào)GSK-3β、p-Tau蛋白的表達(dá)發(fā)揮鬧保護(hù)作用。

綜上所述，NBP可以改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，其機(jī)制可能是下調(diào)GSK-3β、p-Tau蛋白的表達(dá)，從而抑制Tau磷酸化，達(dá)到腦保護(hù)作用。

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（收稿日期：2020-04-10）