安崇文，李海霞，焦莉莉

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100034)

血清蛋白電泳(SPE)是對(duì)血清中蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)和量篩查的一種常見(jiàn)方法，尤其在腎病(如腎病綜合征、單克隆免疫球蛋白相關(guān)腎損傷)、肝硬化和漿細(xì)胞病(如多發(fā)性骨髓瘤)患者最具有特征性的變化，也是臨床對(duì)M蛋白血癥篩查最常見(jiàn)的一種手段，臨床診斷上意義重大，其診斷性能特征決定性取決于分析技術(shù)和評(píng)估質(zhì)量[1]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于醋酸纖維素薄膜電泳法(CAE)和瓊脂糖凝膠電泳法(AGE)檢測(cè)SPE已有報(bào)道[2-5]，國(guó)內(nèi)采用毛細(xì)管電泳法(CE)檢測(cè)SPE大多使用法國(guó)Sebia Capillarys電泳儀，相關(guān)研究也是基于該儀器的結(jié)果[6]，國(guó)內(nèi)有關(guān)Helena V8全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀的研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP文件對(duì)該儀器檢測(cè)SPE的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用提供幫助。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 檢測(cè)系統(tǒng)為配套系統(tǒng)，應(yīng)用Helena V8全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀，檢測(cè)系統(tǒng)試劑(Serum Protein SPE Kit批號(hào)：11471987，Storage Buffer批號(hào)：11512830，Maintenance Buffer批號(hào)：11494749，Serum Control-Normal批號(hào)：11394452，Serum Control-Abnormal批號(hào)：11404273)。

1.2評(píng)價(jià)方法 參考CLSI提出的EP評(píng)價(jià)方案對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)性能進(jìn)行評(píng)估。

1.2.1精密度評(píng)估 參考CLSI EP5-A2文件[7]進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.2正確度評(píng)價(jià) 參考CLSI EP15-A2[8]推薦的分析具有指定值的物質(zhì)，對(duì)2016年和2017年度美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)發(fā)放的室間質(zhì)評(píng)物(ELP-A、ELP-B)及原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心發(fā)放的室間質(zhì)評(píng)物及廠家提供的指定值物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3相關(guān)性和偏差分析 參考CLSI EP9-A2文件[9]，選取本院患者血清標(biāo)本40份，其SPE結(jié)果涵蓋正常和異常標(biāo)本。分析系統(tǒng)間的相關(guān)性和偏差,并計(jì)算生物參考區(qū)間水平時(shí)的預(yù)期偏差(Bc)。以原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)(EQA)標(biāo)準(zhǔn)的允許總誤差評(píng)判是否可接受，清蛋白(ALB)、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白允許偏差分別為10%、15%、15%、15%、10%。

1.2.4生物參考區(qū)間驗(yàn)證 參考CLSI C28-A3c文件[10]，選取本院健康體檢人員男女各60例，年齡19～78歲，中位年齡42歲。結(jié)果與廠家給定的參考區(qū)間進(jìn)行比較，以≤2例的檢測(cè)結(jié)果在給定參考區(qū)間外作為可接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5穩(wěn)定性評(píng)估 取8份患者血清，于采集2 h內(nèi)進(jìn)行SPE檢測(cè)，分別于室溫(18～28 ℃)避光、4 ℃避光、-20 ℃避光條件下保存，標(biāo)本采集后4、8、12 h及第1～10天進(jìn)行SPE檢測(cè)，與采集2 h內(nèi)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較并計(jì)算平均偏差。

1.2.6M蛋白篩查情況評(píng)估 病例組選取89例免疫固定電泳法陽(yáng)性的血清標(biāo)本，對(duì)照組選取81例免疫固定電泳法健康體檢人員血清標(biāo)本，將結(jié)果整理成四格表進(jìn)行真實(shí)性評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析；偏差分析采用方差分析及Bland-Altman 差異分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1精密度評(píng)估 利用EP5-A2精密度方案進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果符合要求，見(jiàn)表1。

表1 SPE EP5-A2的精密度驗(yàn)證結(jié)果(%)

2.2正確度驗(yàn)證

2.2.1檢測(cè)原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心EQA物質(zhì)的偏差結(jié)果 原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心規(guī)定的允許總誤差，ALB、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白分別為20%、30%、30%、30%、20%，見(jiàn)表2、表3。

表2 檢測(cè)原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心EQA物質(zhì)的偏差結(jié)果(%)

表3 檢測(cè)CAP能力驗(yàn)證物質(zhì)的偏差結(jié)果(%)

2.2.2檢測(cè)Helena廠家提供具有指定值物質(zhì)的偏差結(jié)果 由于上述評(píng)價(jià)物質(zhì)均不能把β1和β2球蛋白組分區(qū)分開(kāi)，故本研究又采用了廠家提供的具有指定值的評(píng)價(jià)物質(zhì)，其驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4，通過(guò)驗(yàn)證。

2.3相關(guān)性和偏差分析 CE和AGE檢測(cè)SPE呈正相關(guān)，ALB、α1球蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.958 0、0.609 0、0.945 9、0.910 1、0.975 2(P<0.01)，其中僅α1球蛋白顯示為中度相關(guān)；對(duì)CE和AGE檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析，F(xiàn)值均大于F0.01(1.40)=7.31，證實(shí)二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。偏差分析顯示，平均絕對(duì)偏差分別為-4.14%、2.80%、-1.86%、1.24%、1.98%，平均相對(duì)偏差為-7.79%、124.61%、-18.24%、11.33%、14.87%。CE和AGE檢測(cè)α1、α2球蛋白結(jié)果間存在明顯差異，結(jié)果一致性較差，無(wú)可比性，見(jiàn)表5。

表4 檢測(cè)Helena廠家提供具有指定值物質(zhì)的偏差結(jié)果(%)

表5 CE系統(tǒng)在參考區(qū)間處可接受性評(píng)估(%)

2.4參考區(qū)間驗(yàn)證 男性和女性生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表6、表7、圖1。α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白超出了規(guī)定數(shù)量，驗(yàn)證不通過(guò)，證明廠家提供的美國(guó)人參考區(qū)間不適合我國(guó)人群。

表6 男性生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果(n=60)

2.5不同溫度條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)偏差結(jié)果 比較8份標(biāo)本在4 h至第10天不同溫度、不同時(shí)間條件下與采集2 h內(nèi)結(jié)果的差異，見(jiàn)表8～10，變化明顯的為β2球蛋白，其在室溫和4 ℃避光保存平均偏差呈負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，-20 ℃避光保存平均偏差均<10%；如果以偏差<10%為標(biāo)準(zhǔn)，提示室溫不宜超過(guò)8 h，4 ℃冰箱不宜超過(guò)4 d，-20 ℃避光保存10 d結(jié)果可接受。

表7 女性生物參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果(n=60)

圖1 雙清蛋白血癥SPE圖譜

表8 室溫條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)偏差結(jié)果(%)

表9 4 ℃避光條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)偏差結(jié)果(%)

續(xù)表9 4 ℃避光條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)偏差結(jié)果(%)

表10 -20 ℃避光條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)偏差結(jié)果(%)

2.6CE檢測(cè)M蛋白真實(shí)性評(píng)價(jià)結(jié)果 CE檢測(cè)M蛋白的靈敏度為0.753，特異度為0.988，ROC曲線下面積為0.870，95%CI為0.813～0.928。見(jiàn)表11。

表11 CE檢測(cè)M蛋白真實(shí)性評(píng)價(jià)結(jié)果(n)

3 討 論

本研究評(píng)價(jià)的CE檢測(cè)SPE的批內(nèi)、批間CV均小于我國(guó)原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心規(guī)定的1/4和1/3允許總誤差，而且均小于文獻(xiàn)[2-5]報(bào)道的CAE和AGE的精密度，在重復(fù)性上CE較凝膠法有明顯優(yōu)勢(shì)，這可能是因?yàn)?，一般基于凝膠條件下的電泳其蛋白質(zhì)的分布是先在凝膠載體上進(jìn)行定性，然后再基于染料的結(jié)合量進(jìn)行半定量，屬于定性-半定量檢測(cè)。而CE是通過(guò)214 nm處的紫外光檢測(cè)蛋白質(zhì)肽帶直接進(jìn)行半定量檢測(cè)。

正確度驗(yàn)證顯示，對(duì)原衛(wèi)生部EQA和美國(guó)CAP能力驗(yàn)證物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均通過(guò)驗(yàn)證，而本研究也同時(shí)檢測(cè)第3方機(jī)構(gòu)(伯樂(lè))提供的物質(zhì)，α1球蛋白未通過(guò)驗(yàn)證，相對(duì)偏差已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出允許總誤差(±30%)，分析原因可能與靶值制訂有關(guān)。而伯樂(lè)提供的靶值未把CE結(jié)果納入其中。由于上述評(píng)價(jià)物均不能把β1球蛋白和β2球蛋白組分區(qū)分開(kāi)，故本研究又采用了廠家提供的具有指定值的評(píng)價(jià)物質(zhì)，結(jié)果通過(guò)驗(yàn)證。

相關(guān)分析顯示，CE和AGE檢測(cè)SPE呈正相關(guān)，僅α1球蛋白組分顯示為中度相關(guān)(r=0.609 0)，其余均顯示為高度相關(guān)。CE和AGE檢測(cè)結(jié)果經(jīng)方差分析顯示，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。偏差分析顯示，α1球蛋白、α2球蛋白、γ球蛋白的平均相對(duì)偏差為124.61%、-18.24%、14.87%，均超出了規(guī)定。α1球蛋白、α2球蛋白在生物參考區(qū)間處的預(yù)期偏差也不可接受。整體來(lái)看CE與AGE檢測(cè)α1球蛋白、α2球蛋白、γ球蛋白結(jié)果存在明顯差異，結(jié)果一致性較差，無(wú)可比性，這與該組分中蛋白質(zhì)所含的脂類或糖類多少有關(guān)，這些脂類或糖類是不能被蛋白染料著色的，如脂蛋白中的脂類和α1酸性糖蛋白中的糖類(如唾液酸)，α1酸性糖蛋白含糖量為45%，這些物質(zhì)在基于凝膠的電泳中都會(huì)影響與染料結(jié)合，導(dǎo)致蛋白檢測(cè)比實(shí)際偏低。而在CE中應(yīng)用的是直接紫外吸光度測(cè)量，不受這些脂類和糖類的影響，這是造成CE檢測(cè)α1球蛋白等組分與AGE偏差較大的原因，故CE的α1球蛋白組分參考區(qū)間也會(huì)明顯高于凝膠法。

生物參考區(qū)間驗(yàn)證顯示，α2球蛋白、β1球蛋白、γ球蛋白超出了規(guī)定數(shù)量，驗(yàn)證不通過(guò)，證明廠家提供的39例美國(guó)人參考區(qū)間不適合我國(guó)人群，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制訂本實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間。在驗(yàn)證期間發(fā)現(xiàn)1例雙清蛋白血癥標(biāo)本(圖1)，CE顯示ALB組分明顯分出2個(gè)峰，而AGE的ALB區(qū)帶并未出現(xiàn)2條條帶，而是出現(xiàn)1條較寬條帶，這可能與CE檢測(cè)SPE時(shí)增加了ALB組分的分辨率有關(guān)，導(dǎo)致CE對(duì)雙清蛋白血癥的檢測(cè)更加靈敏，這與國(guó)外報(bào)道采用CE比AGE發(fā)現(xiàn)雙清蛋白血癥例數(shù)多是相符的[11]。本例雙清蛋白血癥個(gè)體屬于健康體檢人員，并未大量使用抗菌藥物(如青霉素)和水楊酸等，也無(wú)胰腺疾病，可能與ALB的遺傳性基因變異相關(guān)，ALB有20多種遺傳變異，而這些個(gè)體是可以不表現(xiàn)出病癥的。

標(biāo)本穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，β2球蛋白組分變化最明顯，這與血清中補(bǔ)體蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定有關(guān)。補(bǔ)體蛋白占總蛋白的10%左右，其中補(bǔ)體C3、C4屬于β球蛋白，補(bǔ)體C3又是水平最高的，而β2球蛋白組分中主要是C3蛋白，易受各種理化因素的影響，溫度過(guò)高、紫外線照射等均可遭到破壞，在室溫和4 ℃保存時(shí)間越長(zhǎng)，β2條帶越不清晰。故建議室溫避光保存8 h，4 ℃避光保存4 d，這與文獻(xiàn)[6]報(bào)道有差異。

對(duì)于SPE而言，最重要的就是發(fā)現(xiàn)并定量單克隆蛋白質(zhì)(即M蛋白)，而CE篩查M蛋白的靈敏度不僅與AGE一致性較好[12-13]，還可以對(duì)M蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。本研究的靈敏度為0.753，準(zhǔn)確度為0.988，ROC曲線下面積為0.870，由此證實(shí)CE對(duì)于篩查M蛋白有良好的準(zhǔn)確度，診斷價(jià)值較大。

本研究在篩查M蛋白試驗(yàn)中，81例對(duì)照組中有1例采用CE檢測(cè)為M蛋白假陽(yáng)性，分析原因可能與該標(biāo)本為高球蛋白血癥有關(guān)。增多的IgA導(dǎo)致β2區(qū)峰值或β2與γ區(qū)間峰值增大造成錯(cuò)誤解讀。89例M蛋白陽(yáng)性標(biāo)本中，有22例未被CE檢出，經(jīng)免疫固定電泳法檢測(cè)其中8例為輕鏈型(7例弱陽(yáng)性、1例與β區(qū)重合)，2例為IgAλ型(與β重合)，3例為IgGλ型(弱陽(yáng)性)，2例為IgMλ型(弱陽(yáng)性)，4例為IgMκ型(3例弱陽(yáng)性、1例與β區(qū)重合)，1例為IgAκ型(與β區(qū)重合)，1例為IgGκ(弱陽(yáng)性)和1例為IgG、IgM、κ、λ寡克隆型，綜合分析，可能被CE漏檢的M蛋白為單克隆輕鏈型患者、單克隆蛋白與β區(qū)或β1區(qū)重合的患者、低水平單克隆蛋白患者和寡克隆或雙克隆蛋白水平少的患者等。當(dāng)患者存在少量M蛋白時(shí)，尤其背景中再加上多克隆免疫球蛋白增值的情況下，這些隱藏在正常區(qū)帶中的小單克隆蛋白是很難被CE和AGE檢出的，這種小單克隆蛋白的存在雖然尚未確定臨床意義，但它是反映疾病情況的線索，應(yīng)加以重視[14]，如B細(xì)胞淋巴瘤、白血病、化學(xué)免疫抑制劑作用、原發(fā)性巨球蛋白血癥、重鏈病、輕鏈病、原發(fā)性淀粉樣變性、意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥、多神經(jīng)病、皮膚黏液水腫樣苔蘚、多種慢性感染、結(jié)締組織病、非網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)腫瘤、脂肪代謝障礙、慢性肝病、病毒感染、藥物過(guò)敏、癌腫、惡性淋巴瘤、自身免疫性疾病和免疫復(fù)合物疾病等均可能出現(xiàn)小單克隆蛋白區(qū)帶，同時(shí)進(jìn)行免疫固定電泳法檢測(cè)可彌補(bǔ)上述不足。

4 結(jié) 論

CE檢測(cè)SPE的優(yōu)勢(shì)在于增加了ALB、β球蛋白組分的分辨率，并且可對(duì)M蛋白進(jìn)行量化，使雙清蛋白血癥更易檢出，區(qū)分開(kāi)β1和β2球蛋白組分，β1球蛋白中主要是轉(zhuǎn)鐵蛋白，β2球蛋白中主要是補(bǔ)體C3，若M蛋白在β2區(qū)，AGE由于重合，很難分辨出來(lái)，而CE會(huì)使與β2區(qū)重疊的M蛋白更易檢出，可為臨床診斷和治療提供更多信息。