劉 航，何佳琪，王小鳳，李明奇，郭 嘉，趙天藝，張 樊，吳長新，張 輝

（石河子大學動物科技學院 動物疾病防控兵團重點實驗室，石河子 832003）

布魯菌病是我國二類動物疫病，是一種人獸共患傳染病。家畜感染布魯菌的臨床癥狀一般表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大，體溫升高，母畜表現(xiàn)為流產(chǎn)和死胎。目前，布病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷升高[1]，各國都加強了對布魯菌病的重視，以避免布病帶來的經(jīng)濟損失和對公共衛(wèi)生的危害[2]。

布魯菌病引起母畜流產(chǎn)是由于胚胎滋養(yǎng)層細胞受到了損害[3]，而布魯菌的經(jīng)典毒力因子有脂多糖、四型分泌系統(tǒng)[4]、外膜蛋白以及Bvr R/Bvr S雙組分系統(tǒng)等[5]。在布魯菌造成機體慢性感染的過程中，四型分泌系統(tǒng)起著重要的作用，其分泌的效應(yīng)因子可以引起機體各方面的紊亂，這些效應(yīng)因子的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)類以及核蛋白復合體的結(jié)構(gòu)相似。在機體被其感染后可誘導產(chǎn)生IL-18等多種炎癥因子并引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。IL-1β和TNF-α等促炎因子在機體抵抗病原過程中發(fā)揮重要作用[7]。我們在前期研究中，已篩選出了布魯菌的一個效應(yīng)分子VceA，并證實了其在弱毒株中的表達量低于強毒株。但是VceA在布魯菌感染機體的過程中功能尚不明確。本研究培養(yǎng)布魯菌S2308的VceA基因缺失株，分析其生長特點并與親本株做比較。布魯菌VceA基因缺失株侵染HTP-8細胞后，對細胞的炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌水平進行檢測；用ΔVceA感染小鼠，采集脾臟組織，進行CFU計數(shù)。本研究為進一步探究T4SS分泌蛋白VceA的功能提供理論基礎(chǔ)，對于有效的防控布魯菌病，維護社會公共衛(wèi)生安全有著重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌株布魯菌2308株由石河子大學動物科技學院人獸共患病重點實驗室保存；布魯菌VceA基因缺失株由實驗室構(gòu)建。

1.2 試驗動物27只SPF級BALB/c小鼠，5-7周齡，雌性，體重（20±2）g，購于新疆醫(yī)科大學動物中心。

1.3 試劑布魯菌固體培養(yǎng)基（BrucellaAgar）和液體培養(yǎng)基（BrucellaBroth）均購自BD公司；氨 青霉素以及卡那青霉素購自Pfizer公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.4 布魯菌的培養(yǎng)將保存在-80℃冰箱的布魯菌S2308和S2308的基因缺失株ΔVceA取出，于超凈生物安全柜中在布魯菌固體培養(yǎng)基上“四區(qū)法”畫線，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)2 d。

1.5 牛種布魯菌ΔVceA生長特性檢測 分別挑取S2308的基因缺失株ΔVceA單克隆菌落置于布魯菌液體培養(yǎng)基中200 r/min、37℃培養(yǎng)至D600為0.1時，每隔120 min收取一次菌液，滅活檢測D600的值，繪制生長曲線圖。

1.6 HPT-8細胞的侵染及細胞因子的檢測

1.6.1 細菌侵染細胞 使用6孔板進行細胞侵染實驗，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，按照侵染復數(shù)MOI=100∶1將布魯菌加至細胞上清液中，混勻后置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中1 h；每孔加入3.5 μL/mL硫酸慶大霉素作用50 min后，棄細胞培養(yǎng)液；PBS清洗3次后添加新的細胞培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6.2 侵染HPT-8細胞后細胞因子的檢測 分別用S2308和ΔVceA侵染HPT-8細胞，并于3 h、12 h、24 h收取細胞上清液，并分別用TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒檢測其表達量，繪制標準曲線，結(jié)果見圖1。

1.7 侵染HPT-8細胞后CFU計數(shù)將生長狀態(tài)良好的HPT-8細胞移至新的6孔板中，每孔細胞個數(shù)約為106。當細胞貼壁后，加入生長到對數(shù)生長期的菌量為108的布魯菌S2308株和ΔVceA，分別在侵染3 h、12 h 和24 h時用曲拉通裂解細胞，梯度稀釋后涂布至布魯菌固體培養(yǎng)基，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)3 d，進行CFU計數(shù)。

圖1 炎性細胞因子標準曲線Fig.1 The standard curve of inflammatory cytokines

1.8 感染小鼠模型的建立將保存在-80℃冰箱的布魯菌S2308和S2308的基因缺失株ΔVceA取出，于生物安全柜中在布魯菌固體培養(yǎng)基上“四區(qū)法”畫線，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)2～3 d，進行CFU計數(shù)。每組9只小鼠，每只小鼠腹腔注射200 μL CFU計數(shù)為5×106moL/L的布魯菌S2308株和S2308的基因缺失株ΔVceA，對照組的小鼠腹腔注射等量的PBS緩沖液。

1.9 小鼠脾臟的CFU計數(shù)分別于兩組小鼠腹腔注射布魯菌后第1 d、7 d、14 d、28 d、56 d時，在無菌環(huán)境中取出小鼠脾臟，將脾臟組織剪碎后放入無菌的EP管中，加入800 μL的PBS進行30 min勻漿，用PBS緩沖液進行梯度稀釋，第1 d、7 d、14 d時用103和104的稀釋度涂布布魯菌固體培養(yǎng)基，第28 d、56 d時選用102和103稀釋度涂布，密封，37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)3 d后計算生長的菌落數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌S2308株ΔVceA及其親本株S2308生長曲線 通過觀察布魯菌S2308株ΔVceA及S2308的生長曲線，布魯菌S2308株ΔVceA與S2308生長到對數(shù)期和平臺期的時間分別是12 h和24 h，見圖2。S2308株ΔVceA及S2308的生長曲線無明顯差異，這表明布魯菌VceA基因的缺失不影響布魯菌的生長。

圖2 布魯菌S2308ΔVceA與其親本株S2308的生長曲線Fig.2 The gowth curve of Brucella S2308 ΔVceA strains and S2308 strain

2.2 VceA 缺失株對HPT-8細胞的細胞因子分泌的影響在布魯菌侵染HPT-8細胞3 h、12 h和24 h時收取上清液，根據(jù)檢測TNF-α和IL-1β炎癥因子的試劑盒說明書操作，用酶標儀在D450處測定吸光值，然后依據(jù)標準曲線公式來計算TNF-α和IL-1β的濃度，結(jié)果見圖3。在布魯菌侵染細胞后3 h、12 h和24 h時，侵染組TNF-α和IL-1β的分泌量均高于對照組，在布魯菌侵染細胞后12 h時親本株組的TNF-α和IL-1β的分泌量均高于缺失株組。

2.3 牛布魯菌ΔVceA侵染HPT-8細胞后及感染小鼠后的CFU計數(shù) 布魯菌ΔVceA及其親本株S2308以100∶1侵染復數(shù)侵染HPT-8細胞，在侵染后第0 h、3 h、12 h、24 h時用曲拉通裂解細胞，收樣稀釋到102和103后分別涂布至布魯菌固體培養(yǎng)基，密封，37℃倒置培養(yǎng)3～5 d后計算菌落數(shù)，繪制折線圖（圖4A）。結(jié)果顯示，布魯氏菌ΔVceA在侵染12 h時CFU計數(shù)顯著低于親本株，在侵染24 h時和親本株S2308差異不顯著，不具有統(tǒng)計學意義。

兩組小鼠腹腔注射后，于感染后第1 d、7 d、14 d、28 d 和56 d時無菌取出小鼠脾臟，勻漿后加入PBS梯度稀釋，涂布至布魯菌固體培養(yǎng)基，密封，37℃倒置恒溫培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)，結(jié)果見圖4B，ΔVceA在感染后第14 d時顯著低于親本株（P<0.01），之后有上升的趨勢，在第28 d時和親本株差異不顯著，不具有統(tǒng)計學意義。

圖3 細胞因子表達量Fig.3 The expressions of cytokines

3 討論

布魯菌的T4SS是一種多蛋白復合體，研究布魯菌T4SS對研究布魯菌的致病機理有很大幫助[8]。T4SS首次被發(fā)現(xiàn)時的效應(yīng)因子就有VceA，其分泌的效應(yīng)因子能夠幫助布魯菌在細胞內(nèi)的生存，對機體持續(xù)造成感染[9]。研究表明，T4SS分泌的效應(yīng)蛋白VceA是由105個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在已公布的布魯菌基因組中都是保守的，VceA編碼的蛋白質(zhì)是T4SS的蛋白新底物[10-12]。

圖4 牛布魯菌ΔVceA和S2308在HPT-8細胞中的存活能力和在小鼠脾臟中的載菌量Fig.4 Survival ability of Brucella bovis ΔVceA and S2308 in HPT-8 cells and their carrying capacity in mouse spleen

布魯菌感染機體后，巨噬細胞和單核細胞均能快速識別病原菌的入侵，釋放的促炎因子在感染初期對NLRP3炎癥小體有暫時的抑制作用，并通過這條途徑抑制相關(guān)細胞因子IL-1β和IL-18的表達，而胞外其他致炎因子的表達量也會因為IL-1β和IL-18分泌到胞外的刺激而升高。史靜雪等[15]在對VceA研究中發(fā)現(xiàn)，VceA蛋白刺激細胞后，細胞的炎性因子IL-1β、IL-18、TGF-β1和TNF-α的表達量均有不同程度的升高。劉來珍等[14]在研究布魯菌T4SS分泌蛋白功能時也證實了其對細胞因子IL-1β的釋放具有一定的作用。本研究中布魯菌侵染組TNF-α和IL-1β的分泌量均高于PBS對照組、親本株組均高于布魯菌的ΔVceA基因缺失株組，在感染的過程中這些細胞因子分泌量的變化可能與布魯菌胞內(nèi)寄生機制相關(guān)。

本研究用布魯菌S2308基因缺失株ΔVceA侵染HTP-8細胞以及構(gòu)建小鼠感染模型，通過觀察繪制的布魯菌的生長曲線可以看出，布魯菌S2308 ΔVceA缺失株和親本株在生長趨勢上基本一致，證明VceA基因的缺失對布魯菌的生長沒有影響。脾臟作為動物體內(nèi)的免疫器官，從小鼠感染布魯菌的模型采集的脾臟組織進行CFU計數(shù)[16]，缺失株感染初期顯著低于親本株，之后和親本株并無明顯差異，這些變化與布魯菌在體內(nèi)生存能力有著很大關(guān)系，為進一步探索布魯菌四型分泌系統(tǒng)，揭示其致病機理提供依據(jù)。