王 留 劉秀玲 梁 博
(商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南商丘 476100)
黃芩是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,是唇形科多年生草本植物黃芩的干燥根,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其性寒味苦,可除濕、止血安胎、治療肺熱、咳嗽、濕熱、黃痘等,具有抗菌、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化等作用。黃芩苷是從中藥黃芩的干燥根中提取分離得到的一類(lèi)黃酮類(lèi)化合物,屬葡萄糖醛酸苷類(lèi),也是黃芩中藥材中含量最多的黃酮類(lèi)化合物,含量高達(dá)12.1%。藥理研究已證明,黃芩苷具有清熱鎮(zhèn)靜、抑菌抗炎、抗氧化等多方面作用[1-2]。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)測(cè)定黃芩苷對(duì)豬溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度、生長(zhǎng)曲線和溶血素活性抑制等試驗(yàn),探討黃芩苷對(duì)豬溶血性鏈球菌的抗菌作用及機(jī)制,為開(kāi)發(fā)用于豬鏈球菌病治療的黃芩新獸藥制劑提供理論基礎(chǔ)。
黃芩苷,購(gòu)于四川天然藥物有限公司,含量85%,為淡黃色結(jié)晶粉末。用二甲基亞砜配置成12.8 mg·mL-1的溶液備用。
豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株、Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基(THB)、無(wú)菌脫纖維兔血購(gòu)于上海索爾生物科技有限公司。THB培養(yǎng)基按說(shuō)明書(shū)配制,121℃高壓滅菌后備用。
采用微量稀釋法[3]測(cè)定黃芩苷對(duì)豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株的最小抑菌濃度(MIC),經(jīng)2倍倍比稀釋后,黃芩苷的終濃度分別為1 280、640、320、160、80、40、20、10 μg·mL-1。試驗(yàn)重復(fù) 3 次,取 3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值作為黃芩苷對(duì)豬鏈球菌2型的MIC。
參考張偉等[4]文獻(xiàn)報(bào)道的方法,豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株接種于100 mL THB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(37℃,200 rpm)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期(OD600nm=0.3),分裝于5個(gè)50 mL錐形瓶中,每瓶15 mL。分別在5個(gè)錐形瓶的豬鏈球菌培養(yǎng)物中加入黃芩苷溶液,使培養(yǎng)液中黃芩苷的終濃度分別為0、8、16、32、64 μg·mL-1,繼續(xù)培養(yǎng)至5 h,期間每隔0.5 h分別測(cè)定每瓶豬鏈球菌培養(yǎng)物的OD600nm光密度值,繪制豬鏈球菌的生長(zhǎng)曲線。
豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株接種于100 mL THB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(37℃,200 rpm)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期(OD600nm=0.3),分裝于5個(gè)50 mL錐形瓶中,每瓶15 mL。分別在5個(gè)錐形瓶的豬鏈球菌培養(yǎng)物中加入黃芩苷溶液,使培養(yǎng)液中黃芩苷的終濃度分別為0、8、16、32、64 μg·mL-1,繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。分別將每瓶豬鏈球菌培養(yǎng)物10 000 rpm高速冷凍離心1 min,分離上清液。分別在1.5 mL離心管加入磷酸鹽緩沖液(PBS)875 μL、豬鏈球菌培養(yǎng)物上清液100 μL、脫纖維兔紅細(xì)胞25 μL,混勻,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置0.5 h,然后10 000 rpm高速冷凍離心1 min,分離上清液,測(cè)定上清液的OD450nm光密度值。
試驗(yàn)結(jié)果顯示,黃芩苷對(duì)豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株的最小抑菌濃度大于1 280 μg·mL-1,說(shuō)明黃芩苷對(duì)豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株抑菌效果較差。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類(lèi)化合物,具有廣泛的藥理活性和生物學(xué)功能[1]。陳功義等[5]采用細(xì)胞模型試驗(yàn)研究了黃芩苷對(duì)豬細(xì)小病毒感染豬腎細(xì)胞的體外作用,結(jié)果顯示黃芩苷能夠顯著阻斷豬細(xì)小病毒感染豬腎細(xì)胞,對(duì)豬細(xì)小病毒引起的細(xì)胞病變有一定的抑制作用,阻斷和抑制效應(yīng)與黃芩苷的濃度梯度呈正相關(guān)。閆靜等[6]體外試驗(yàn)結(jié)果表明,黃芩苷能夠干擾病毒的復(fù)制和阻滯病毒的侵入,能有效抑制傳染性法氏囊病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞。楊靜[7]采用微量稀釋法研究了黃芩苷對(duì)豬常見(jiàn)致病菌的最小抑菌濃度,結(jié)果表明黃芩苷對(duì)豬大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性,對(duì)鏈球菌抗菌效果較差,對(duì)沙門(mén)氏菌和巴氏桿菌無(wú)明顯的抗菌作用。魏滋鴻等[8]、張偉等[9]、劉通等[10]分別研究了黃芩提取物對(duì)單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抗菌作用,結(jié)果提示黃芩提取物對(duì)單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩苷對(duì)豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株抑菌效果較差。
豬鏈球菌生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1,試驗(yàn)顯示黃芩苷在0~64 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)對(duì)豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。魏滋鴻等[8]、張偉等[9]、劉通等[10]分別研究了黃芩提取物對(duì)單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響,結(jié)果提示黃芩提取物在0~64 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)對(duì)單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用,本試驗(yàn)結(jié)果與其相一致。
黃芩苷抑制豬鏈球菌溶血素活性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)果表明黃芩苷與豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株共培養(yǎng)后,能夠顯著抑制培養(yǎng)物上清液中豬鏈球菌溶血素的溶血活性,黃芩苷添加濃度為32~64 μg·mL-1時(shí),豬鏈球菌溶血素活性與對(duì)照組(0 μg·mL-1組)相比差異顯著。溶血素是豬鏈球菌2型細(xì)菌產(chǎn)生的一種外毒素,具有溶血和細(xì)胞毒性,是豬鏈球菌的主要毒力因子,對(duì)豬鏈球菌的感染和免疫都有重要影響,破壞溶血素的溶血活性是降低豬鏈球菌致病力的主要治療措施之一。張偉等[9]、李根等[11]、陳慶忠等[12]分別研究了黃芩提取物、藥桑提取物、銀杏葉提取物對(duì)豬鏈球菌溶血素活性的影響,試驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩提取物、藥桑提取物、銀杏葉提取物均可顯著抑制豬鏈球菌溶血素介導(dǎo)的溶血活性,本試驗(yàn)結(jié)果與其相一致。
表1 黃芩苷對(duì)豬鏈球菌溶血素活性的抑制作用