李承德 ，周樂樂，高鳳磊，黃康法，嚴常燕，黃曉剛，范玉珊，張發(fā)良，李 莉，鄭熙燦，張守全，衛(wèi)恒習*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東廣州 510642；2.廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學院，廣東廣州 510507；3.佛山市南海種禽有限公司，廣東佛山 528222）

雞的人工授精產(chǎn)生于20 世紀30 年代，Burrows 等[1]首先建立了雞的按摩法采精技術(shù)并一直沿用至今。1977年，Sexton[2]發(fā)明了一種磷酸鹽稀釋液BPSE（Belsville Poultry Semen Extender），在家禽精液保存中得到廣泛應(yīng)用。未稀釋的家禽精液受精力會迅速喪失，稀釋后可延長精液體外保存時間；雞精液體外保存效果受稀釋液種類、保存溫度等條件影響[3]。Sexton[2]和Lake 等[4]將稀釋后的雞精液保存在2～5℃條件下24 h，輸精后獲得較好的受精率。人工授精技術(shù)有助于提高優(yōu)良種公雞的利用效率和養(yǎng)雞生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，因此被廣泛應(yīng)用于集約化規(guī)模化種雞場。但在實際生產(chǎn)中，雞人工授精技術(shù)仍存在諸如勞動量大、精液保存時間短等問題，致使有些雞場仍使用原精輸精，精液利用效率降低，受精率下降、采精勞動強度增加[5-6]。

雞精液稀釋與保存是人工授精技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，雖然國內(nèi)外學者在稀釋液開發(fā)和精液保存上做了大量工作，但效果仍不理想，保存6 h 后精子活率普遍較低[3]。雞精液密度大、易發(fā)生凝集、體外存活時間短，只有經(jīng)過稀釋處理才能進行有效的保存和運輸[7]。精液體外保存效果受到稀釋液成分、滲透壓、pH、精液稀釋比例、保存溫度等多種因素的影響[3]。近年來研究表明，稀釋液中添加適量的褪黑素等抗氧化劑有助于提高豬、羊、雞的精液保存時間與精子活力[3,8-9]，但對人工授精效果的影響仍不明確。本研究針對我國南方夏季熱應(yīng)激造成種公雞精液品質(zhì)下降的問題，探索不同保存溫度、不同稀釋比例以及添加褪黑素對雞精液體外保存及人工授精效果的影響，以期建立適宜的精液稀釋與保存技術(shù)，來滿足夏季種雞場人工授精的技術(shù)需求，同時為我國南方地區(qū)種雞場人工授精技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 精液采自33 周齡的黃羽種公雞，并立即將不同公雞的精液混勻、備用。褪黑素購自Sigma 公司，用PBS 配成1 mmol/L 濃儲液，-20℃保存?zhèn)溆?。稀釋液Ⅰ參照胡艷娟[10]報道的配方進行配制，4℃保存。稀釋液Ⅱ在稀釋液Ⅰ的基礎(chǔ)上，添加褪黑素0.5 μmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 實驗設(shè)計 本實驗于2019 年7—9 月在廣東某種雞場進行，選用同一雞舍的成年黃羽種公雞21 只、黃羽種母雞400 只進行實驗，實驗種蛋在公司的孵化場進行孵化。首先將采集的公雞精液進行不同比例（1:1、1:2、1:3）稀釋，然后分別在4℃和37℃條件下保存不同時間（0、4、8、24 h）再進行精子活力檢測，同時以雞場不進行稀釋的原精輸精為對照，對不同稀釋液（稀釋液Ⅰ、稀釋液Ⅱ）、不同稀釋比例和不同保存時間的4℃保存精液分別進行人工授精和種蛋受精率的檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 精液采集與稀釋 采用背腹按摩法采集公雞精液，室溫混勻；在37℃下進行常規(guī)精液品質(zhì)檢查并記錄精子活力。然后按照試驗設(shè)計將精液平均分裝到6 個離心管中，分別用稀釋液Ⅰ和稀釋液Ⅱ在37℃等溫條件下分別進行1:1、1:2 和1:3 稀釋，輕搖混勻。再將稀釋后的每份精液平均分成2 管，分別置于37℃和4℃條件下保存。

1.3.2 精液保存與活力檢測 于4℃和37℃條件保存的精液，分別在不同保存時間（0、4、8、24 h）進行精子活力檢查。具體操作是將精液輕輕混勻，取一小部分于1.5 mL 離心管中，置于37℃恒溫加熱板上；將載玻片和蓋玻片放在37℃恒溫板上預(yù)熱5 min，取1 滴精液滴在載玻片，蓋上蓋玻片，立即在顯微鏡下觀察并記錄精子活力。精子活力采用十級評分法，觀察視野中直線前進運動精子的所占的比例。試驗重復(fù)5 次以上。

1.3.3 人工輸精與種蛋孵化 以雞場不進行稀釋的原精輸精為對照，對不同稀釋液（稀釋液Ⅰ、稀釋液Ⅱ）、不同稀釋比例（1:1、1:2 和1:3）和不同保存時間（0、4、8、24 h）的4℃保存精液分別進行人工授精試驗。將400只母雞隨機分為25 組，每組16 只母雞。一組為對照組，用原精液進行輸精；其他24 組為試驗組，分別輸入不同處理保存的精液（2 種稀釋液×3 個稀釋比例×4 個保存時間）。母雞的輸精劑量為0.03 mL/只，間隔5 d輸精1 次。在對母雞進行第3 次輸精的次日開始收集種蛋并做好組別標記，連續(xù)收集7 d，種蛋臨時保存在16℃的貯蛋室，待收集完成后一起入孵。入孵之前清洗好試驗種蛋并消毒，孵化溫度為37.8℃，相對濕度為55%。在入孵后第18 天照蛋，第21 天出苗。觀察和記錄每組的未受精蛋數(shù)、死胎蛋數(shù)、出苗數(shù)、健雛數(shù)等指標。種蛋受精率=受精蛋數(shù)/入孵種蛋數(shù)×100%，出苗率=出苗數(shù)量/受精蛋數(shù)×100%，健雛率=健雛數(shù)/總出雛數(shù)×100%。試驗重復(fù)3 次以上。

1.4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)用Excel 軟件進行整理，結(jié)果以平均值±標準誤表示，采用SPSS 23.0 進行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稀釋液及保存溫度對雞精液精子活力影響 由圖1 可知，不同稀釋液對精子活力沒有影響，不管4℃低溫保存還是37℃常溫保存，稀釋精液的精子活力隨保存時間的延長而降低，但4℃保存效果優(yōu)于37℃保存（P＜0.01）。在4℃條件下，稀釋精液保存0、4、8 h 精子的平均活力分別為0.73、0.70 和0.65（P＞0.05），但保存24 h 的精子活力（0.51）顯著或極顯著低于其他時間點。

2.2 不同稀釋比例對雞4℃低溫保存精液精子活力的影響由表1 可知，不同稀釋比例各組的精子活力均隨著保存時間的延長而降低。在相同稀釋比例下，保存0 h 和4 h的精子活力極顯著高于保存24 h，而保存0、4、8 h 的精子活力差異不顯著。在相同保存時間下，不同稀釋比例對4℃低溫保存精液的精子活力均沒有顯著影響，但隨著稀釋比例的增加而呈下降趨勢。

表1 不同稀釋比例對雞低溫保存精液精子活力的影響

2.3 不同稀釋液對雞人工授精的種蛋受精率、出苗率和健雛率的影響 如表2 所示，不同稀釋液對4℃保存的稀釋精液的人工授精種蛋受精率、出苗率和健雛率均無顯著影響。不同稀釋液保存0、4、8 h 的種蛋受精率、出苗率和健雛率均無顯著差異，但種蛋受精率均高于原精輸精組，表明精液稀釋有助于提高雞人工授精的種蛋受精率；保存24 h 時，稀釋液Ⅰ組和稀釋液Ⅱ組的種蛋受精率均顯著降低。

在保存0～8 h 時，2 種稀釋液的出苗率和健雛率沒有顯著變化；但保存24 h 時，其出苗率和健雛率均顯著性低于其他保存時間組和原精輸精組。

表2 入孵種蛋數(shù)和不同稀釋液對種蛋受精率、出苗率及健雛率的影響

2.4 不同稀釋比例對雞人工授精的種蛋受精率、出苗率和健雛率的影響 如表3 所示，在保存時間相同的情況下，不同稀釋比例的保存精液，其種蛋受精率存在顯著差異。當保存0 h 時，1:1 和1:2 稀釋組的種蛋受精率顯著高于原精輸精組；當保存8 h 時，1:3 稀釋組的受精率顯著低于1:1 稀釋組；而當保存24 h 時，不同稀釋比例各組的受精率與保存0、4、8 h 組相比均極顯著降低，其中1:3 稀釋組的受精率最低，顯著或極顯著低于其他各組。

不同稀釋比例各組精液在4℃保存0、4、8 h 對出苗率和健雛率沒有顯著影響；但保存24 h 則會顯著降低出苗率和健雛率。綜合來看，精液稀釋比例為1:2 時效果較好，在4℃保存0～8 h 不會對人工授精效果產(chǎn)生不良影響，并能擴大雞精液的利用效率。

3 討 論

我國南方夏季炎熱多雨，局部地區(qū)溫度可達40℃，熱應(yīng)激造成的公雞精液品質(zhì)下降問題普遍存在。精液保存溫度影響精子的代謝速率，隨著精液保存時間的延長，精子代謝不僅消耗大量的能量物質(zhì)，而且產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，如乳酸、活性氧（ROS）等，進而影響精子活力和受精能力[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)4℃保存24 h 的精液平均精子活力都在0.5 以上，是適宜的雞精液保存溫度。

精子呼吸代謝產(chǎn)生ROS，可以氧化精子質(zhì)膜的不飽和脂肪酸，使精子受精能力下降[13]。褪黑素具有較強的抗氧化作用，可以減少ROS 含量，降低氧化損傷[14]。褪黑素的抗氧化作用與其添加濃度有關(guān)，在絨山羊精液冷凍稀釋液中添加0.5 mg/mL褪黑素能夠顯著提高絨山羊精子抗氧化能力和冷凍保存效果[15]。在豬精液中添加0.1 μmol/L褪黑素可以顯著提高精液體外保存質(zhì)量和受精能力[16]。李潔等[7]報道，低濃度褪黑素（1.0 μmol/L）有助于延長雞精液低溫保存的存活時間，但高濃度褪黑素（3.0 μmol/L）則不利于精子存活。本研究發(fā)現(xiàn)，在精液中添加0.5 μmol/L褪黑素對雞精液體外保存以及人工授精效果均沒有顯著影響，可能是添加量不足所致。

雞精液精子密度高，對精液進行適當稀釋可增加精液量，充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)種公雞的繁殖性能，降低公雞飼養(yǎng)量，符合種雞場提高生產(chǎn)水平的需求。若采用原精輸精，則公雞母雞比例為1:30；若將原精液稀釋后進行人工輸精，則公雞母雞的比例為1:60～1:90[17]。由于雞的輸精量較少，通常為0.03 mL，因此精液稀釋比例不宜過大。潘越博等[18]對雞精液進行1:1、1:1.5、1:2 稀釋，發(fā)現(xiàn)3 組間受精率沒有顯著差異，但精液稀釋后受精率顯著高于原精液。本研究也發(fā)現(xiàn)，稀釋精液人工授精的受精率顯著高于原精授精組。但稀釋精液的體外保存和人工授精效果受到保存時間的影響，隨著保存時間的延長而降低。在相同保存時間下，精子活力和受精率隨稀釋比例增加而呈下降趨勢，但稀釋比例對出苗率和健雛率沒有顯著影響。在保存8 h 和24 h，1:3 稀釋保存組的受精率顯著降低，這可能是輸精的有效精子數(shù)量降低所致。總體來看，1:2 稀釋組的效果較好，更適合雞場實際生產(chǎn)。

表3 入孵種蛋數(shù)和不同稀釋比例對種蛋受精率、出苗率及健雛率的影響

延長精液保存時間是種雞場人工授精的迫切需求，除了優(yōu)化保存條件外，還可以不斷優(yōu)化精液稀釋液配方來實現(xiàn)延長精液保存時間。秦國棟等[19]用生理鹽水對精液進行稀釋，發(fā)現(xiàn)精液最長保存時間為2 h。Sexton[2]研究發(fā)現(xiàn)，保存 0、4、24 h，保存5℃條件下并暴露于可見光的雞精液稀釋液與對照組的受精率相同，而精清的有無、貯存容器中精液與空氣比率對精子活力無顯著影響。本實驗在種雞場內(nèi)進行，一般是早上在喂食前采精，以防精液混有糞便，若要研究保存10 h 后的人工授精效果，則需要在晚上輸精，不符合實際生產(chǎn)方面的需求，因此本研究只設(shè)置0、4、8、24 h 共4 個時間點。本研究所采用的稀釋液可以在4℃保存24 h 而維持精子活力在0.5 以上，但其精子活力、受精率、出苗率和健雛率均顯著降低，因此在稀釋配方優(yōu)化及長效保存方面仍需進一步研究。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，我國南方地區(qū)夏季雞稀釋精液4℃保存優(yōu)于37℃保存；4℃保存0～8 h 對精子活力、種蛋受精率、出苗率和健雛率沒有顯著影響；稀釋液中添加0.5 μmol/L 褪黑素對精子活力、種蛋受精率、出苗率和健雛率均無影響。綜合來看，以1:2 比例進行精液稀釋4℃保存可獲得較好的精液保存和人工授精效果。