胡 蕾，朱菲菲，王軼敏，張林林，李 新，郭益文，郭 宏，丁向彬

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

骨骼肌中的肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌纖維受損后可增殖、分化、融合成為成熟的肌管或肌纖維來修護(hù)受損的肌細(xì)胞[1-2]。真核細(xì)胞中80%以上的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解由泛素-蛋白酶體完成。主要包括泛素化、蛋白酶體降解、去泛素化3 個(gè)過程[3]。去泛素化是指已經(jīng)泛素化的蛋白質(zhì)在去泛素化酶的作用下水解泛素分子。泛素蛋白酶體中羧基末端水解酶L3（Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3，UCH-L3）屬于UCHs 家族，可以將泛素分子從底物上水解下來，使泛素能夠循環(huán)利用。UCH-L3定位于小鼠的第14號染色體[4]，主要位于造血組織中[5]。已有研究表明，UCH-L3 可以與Smad1 相互作用，顯著降低多聚泛素化的Smad1，可以通過微調(diào)Smad1 信號來加強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化[6]。UCH-L3-/-小鼠中UCH-L3 的缺失會導(dǎo)致骨骼肌中AMP 活化和蛋白激酶活性增強(qiáng)[7]。同時(shí)，UCH-L3 缺失會造成小鼠骨骼肌退化及發(fā)育受阻[8]。以上研究提示UCH-L3 可能在細(xì)胞分化和肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但UCH-L3 對牛肌肉發(fā)育分化是否具有調(diào)控作用還不清楚。本研究利用牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外誘導(dǎo)成肌分化模型，模擬牛骨骼肌生長發(fā)育過程，通過干擾UCH-L3 在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)，研究UCH-L3對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外成肌分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 細(xì)胞為天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離凍存的原代牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑包括DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、Opti-MEM Medium （Gibco）；TRIzolTMReagent，Lipofectamine 3000（Invitrogen）；RIPA 裂解液、電泳緩沖液、電轉(zhuǎn)緩沖液、曝光液、TBS 和PBS（北京索萊寶公司）；Mouse Anti-MyHC Monoclonal Antibody（DSHB）、Mouse Anti-GAPDH Monoclonal Antibody、goat antimouse IgG、goat anti-rabbit IgG（北京中杉金橋公司）；Rabbit Anti-UCH-L3 Monoclonal Antibody（BBI）；FITC-conjugated Goat Anti-X（博士德生物）。

主要儀器為CO2培養(yǎng)箱（Thermo-scientific）、Light Cycle 96 熒光定量PCR 儀（Roche）、熒光倒置顯微鏡（Leica）、電泳儀（Bio-Rad）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化參考本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法進(jìn)行[9]，復(fù)蘇前期實(shí)驗(yàn)室分離凍存西門塔爾牛的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度為80% 時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用生長培養(yǎng)基（DMEM+20%FBS+1%青鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%后，更換為分化培養(yǎng)液（DMEM+2%HS）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)UCH-L3序列設(shè)計(jì)干擾RNA，并由廣東銳博公司合成。將牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞接種于24 孔板，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組3 個(gè)重復(fù)，待細(xì)胞密度至80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔吸棄50 μL 培養(yǎng)基，將25 μL 的Opti-MEM 培養(yǎng)基和1.5 μL 的lip 3000 轉(zhuǎn)染試劑混合液，25 μL 的Opti-MEM 培養(yǎng)基和2.5 μL 的siRNA 混合液分別室溫孵育5 min，再將兩者混合后室溫孵育15 min，每孔細(xì)胞加入50 μL 此混合液，轉(zhuǎn)染6 h后將轉(zhuǎn)染液吸棄，加入增殖培養(yǎng)基。

1.2.3 EdU 細(xì)胞增殖檢測 將牛肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代接種于96 孔板，設(shè)置4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，按照Cell-Light EdU Apollo In Vitro Imaging Kit 試劑盒說明書操作，第一步EdU 標(biāo)記，接著細(xì)胞固定，然后Apollo 染色，最后DNA 染色 。熒光顯微鏡下檢測EdU 陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 免疫熒光染色法檢測分化后肌管中MyHC基因?qū)⑴＜⌒l(wèi)星細(xì)胞傳代接種于48 孔板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞。進(jìn)行成肌誘導(dǎo)分化，分化第3 天時(shí)開始檢測。用預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞2 次。加入4%的多聚甲醛固定30 min，然后用PBS 清洗3 次。用含0.1%Triton X-100 的PBS 室溫通透細(xì)胞20 min，PBS 洗3 次。用5% 的BSA 室溫孵育30 min，棄BSA，不洗。加入一抗，于濕盒中4℃過夜孵育。PBS 清洗3 次，每次5 min，然后加入相應(yīng)的二抗100 μL，37℃避光孵育1 h。PBS 清洗3 次，每次5 min。加入100 μL Hoechst33342避光染色5 min，吸棄，加PBS 后熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測干擾后的UCH-L3 和分化標(biāo)志因子 熒光定量 PCR 體系：cDNA 2 μL，F(xiàn)orward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase free water 7 μL。熒光定量 PCR 程序：預(yù)變性：95℃，60 s；變性：95℃ 10 s；退火：61℃ 20 s；延伸：72℃ 15 s；35 個(gè)循環(huán)；熔解曲線：95℃ 10 s；65℃ 60 s；97℃ 1 s；冷卻：37℃ 30 s。

表1 qRT-PCR 引物信息

1.2.7 Western blot 檢測分化標(biāo)志因子 將6 孔板中的4 個(gè)時(shí)期的細(xì)胞用蛋白裂解液裂解，收集蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，根據(jù)濃度將蛋白變性。在通過Western blot法檢測分化標(biāo)志基因MyHC蛋白的表達(dá)量，具體步驟參考實(shí)驗(yàn)室已建立的方法進(jìn)行[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 EdU 陽性細(xì)胞率和免疫熒光肌管融合率用卡方檢驗(yàn)分析，熒光定量PCR 和Western blot 的結(jié)果用t檢驗(yàn)分析（SPASS 和Image Lab），P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，P＞0.05 表示不顯著。

2 結(jié)果

2.1 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后UCH-L3 表達(dá)量的檢測 提取牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后的蛋白，通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，UCH-L3 表達(dá)在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化前后存在顯著差異（圖1），在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中，增殖細(xì)胞和分化細(xì)胞中的UCH-L3 mRNA 水平無明顯差異，蛋白水平增殖期顯著高于分化期，肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中UCH-L3 蛋白水平的變化提示UCH-L3 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程具有重要的調(diào)控作用。

2.2 UCH-L3-Si-RNA 的設(shè)計(jì)及干擾效果檢測 根據(jù)UCH-L3 序列設(shè)計(jì)si-RNA（si-UCH-L3-1、si-UCH-L3-2、si-UCH-L3-3、si-UCH-L3-4、si-UCH-L3-5），通過熒光定量PCR 技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染24 h 后牛肌衛(wèi)星細(xì)胞中 UCH-L3的表達(dá)量。如圖2 所示，設(shè)計(jì)的5 條si-RNA 均具有顯著的干擾效果，其中si-UCH-L3-3 對UCH-L3 的干擾效果最明顯。

用si-UCH-L3-3 轉(zhuǎn)染牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，進(jìn)一步利用Western blot 技術(shù)檢測si-UCH-L3-3 干擾效果。如圖3所示，相比較si-NC 組，實(shí)驗(yàn)組的UCH-L3 在蛋白水平也顯著降低，說明si-UCH-L3-3 可用于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 干擾UCH-L3 表達(dá)對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響如圖4 所示，對照組和實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞無明顯差異，說明干擾UCH-L3 對細(xì)胞增殖無明顯影響。

2.4 干擾UCH-L3 表達(dá)對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的影響 如圖5 所示，干擾UCH-L3 表達(dá)后形成的肌管明顯少于對照組，肌管融合指數(shù)顯著低于對照組。如圖6 所示，實(shí)驗(yàn)組MyHC 的蛋白水平顯著低于對照組。以上結(jié)果表明干擾UCH-L3 表達(dá)能夠抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化。

3 討 論

正常生物的骨骼肌質(zhì)量占體重的40%，運(yùn)動(dòng)型生物的骨骼肌質(zhì)量占體重的50%，骨骼肌維持著生物體正常的活動(dòng)[10]。成肌細(xì)胞可以增殖和分裂，但一旦融合成肌纖維和肌管便失去增殖能力[11-12]。成肌細(xì)胞在肌肉發(fā)育和肌肉損傷修復(fù)中具有重要作用，在小鼠肌肉內(nèi)注入成肌細(xì)胞，其修復(fù)速度明顯加快[13]。成肌細(xì)胞需要經(jīng)過增殖、分化及融合的順序才能成為肌肉纖維[14]。本研究使用已經(jīng)建立的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外成肌分化模型，可以很好地在體外模擬骨骼肌的發(fā)育過程。

去泛素化酶對體內(nèi)的蛋白泛素化過程起著調(diào)控作用，去泛素化酶可以水解底物與泛素鏈之間的硫酯鍵，一方面在底物靶蛋白降解時(shí)避免泛素鏈也被降解，另一方面還能阻止靶蛋白被過度降解，即實(shí)現(xiàn)對底物靶蛋白降解的調(diào)控。去泛素化酶中大部分為半胱氨酸蛋白酶，根據(jù)其泛素-蛋白酶結(jié)構(gòu)域又可分為泛素特異性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Proteases，USP）、碳末端水解酶（Ubiquitin C-terminal Hydrolases，UCHs）、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶和MJD 酶（含Machado-Joseph 結(jié)構(gòu)域）4 個(gè)亞類。去泛素化酶對泛素-蛋白酶體降解過程的調(diào)節(jié)參與很多重要的生物過程，如細(xì)胞周期的調(diào)控、生長和分化以及腫瘤的發(fā)生[15-16]，其中泛素特異性蛋白酶和碳末端水解酶研究較多。USP19 在萎縮的肌肉中表達(dá)增加，說明泛素蛋白酶體系統(tǒng)可能在骨骼肌中被激活，增加了蛋白的降解，抑制了蛋白的合成[17]。有報(bào)道證明敲除USP4（一種去泛素化酶）改變了MyoD 水平和C2C12 細(xì)胞中肌生成標(biāo)記蛋白水平，從而促進(jìn)了肌生成，故而將USP4 鑒定為肌源性調(diào)節(jié)因子（MRF）的抑制劑[18]。UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5/UCH-L37 和BRCA1 相關(guān)蛋白1（BAP1）是目前發(fā)現(xiàn)的人類碳末端水解酶亞家族的主要成員。UCH-L1基因敲除小鼠的比目魚肌中的肌管比對照組大，C2C12 成肌細(xì)胞中肌管較對照組也是增大的[19]。在小鼠成肌細(xì)胞C2C12 中用si-RNA 敲低UCH-L1基因表達(dá)抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)了細(xì)胞分化和肌管形成[20]。UCH-L3 具有促進(jìn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而促進(jìn)脂肪形成的作用[21]。UCH-L3 可以使多聚泛素化底物蛋白去泛素化。有研究表明UCH-L3-/-小鼠中UCH-L3 的缺失會導(dǎo)致骨骼肌中多聚泛素化蛋白大量增加并誘發(fā)應(yīng)激反應(yīng)[22]。同時(shí)，UCH-L3 的缺失會造成小鼠骨骼肌退化及發(fā)育受阻。上述研究表明去泛素化酶在肌肉發(fā)育分化中發(fā)揮了重要作用，但UCH-L3對牛肌肉發(fā)育分化是否具有調(diào)控作用還不清楚。本研究檢測結(jié)果表明，分化前后牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中UCH-L3的表達(dá)量存在差異，提示UCH-L3 可能調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化；然后利用牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外誘導(dǎo)成肌分化模型，通過干擾UCH-L3 在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明干擾UCH-L3 后分化形成肌管的數(shù)量少于對照組，肌管融合指數(shù)顯著低于對照組，分化標(biāo)志因子MyHC 的蛋白水平顯著低于對照組。本研究表明UCH-L3 對牛肌衛(wèi)星成肌分化非常重要，抑制UCH-L3 表達(dá)時(shí)抑制了牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。UCH-L3 在牛肌肉發(fā)育分化中與在小鼠中的作用相似，干擾UCH-L3 表達(dá)后牛肌衛(wèi)星細(xì)胞中的肌管形成被抑制。

4 結(jié) 論

本研究以牛肌衛(wèi)星體外成肌誘導(dǎo)分化模型為基礎(chǔ)，分析 UCH-L3 對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化的調(diào)控作用，結(jié)果表明干擾UCH-L3 能夠抑制牛骨骼肌衛(wèi)星分化的過程，可為進(jìn)一步研究UCH-L3 在牛肌肉發(fā)育分化中的調(diào)控機(jī)制提供一定參考。