查星琴 ，成文敏，潘偉榮，李海昌，張 瑩，霍金龍，黃 英

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，云南昆明 650201）

版納微型豬近交系（Banna Minipig Inbred Line，BMI）在發(fā)育、生理、解剖、病理、疾病發(fā)生等諸多方面與人類極其相似，是研究轉(zhuǎn)基因動物、異種器官移植、生物醫(yī)學及豬基因組計劃中功能基因的理想實驗動物模型[1-4]。本實驗室通過長期的統(tǒng)計、觀察和基礎研究發(fā)現(xiàn)，BMI 在培育過程中，繁殖力較低的亞系精液品質(zhì)相對較差、畸形率較高。但常規(guī)的精液品質(zhì)指標對于評估公豬的繁殖力具有一定局限性，從分子方面對精液品質(zhì)進行選擇標記，研究與精液品質(zhì)相關的基因，有利于快速和準確地篩選精液，為公畜繁殖育種提供科學依據(jù)。

精漿蛋白是由哺乳類雄性動物性腺、副性腺分泌的對精子細胞形成發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)功能的一類多功能蛋白。精子黏附蛋白家族（AQNl、AQN3、AWN、PSP-I和PSP-II）含量占精漿總蛋白的90% 以上，是公豬精漿蛋白的主要成分[5]，在精子獲能、頂體反應、運動（超活化）及精卵融合中具有重要調(diào)控作用[5-9]。豬精漿蛋白-I（Porcine Seminal Protein-I，PSP-I）和豬精漿蛋白-II（Porcine Seminal Protein-II，PSP-II）是2 個主要的精子黏附蛋白成員，其含量占精漿總蛋白的50%以上，主要在精囊腺表達，在其他副性腺組織中僅有少量表達[10]。二者分子量為14～16 ku，序列同源性為45.2%，氨基酸序列中均含有1 個CUB 結構域，分別由109 和116 個氨基酸殘基組成成熟肽。PSP-I 和PSP -II 主要以非共價異源二聚體形式存在于精漿中，主要參與生殖免疫調(diào)控、精子能動性維持、精子膜完整性、精子線粒體活性、受精等一系列重要的生殖過程[11-12]。目前，對PSP-I 蛋白的研究鮮有報道，在BMI 上更是未見報道。本研究采用RT-PCR 方法克隆BMI 的PSP-I基因并對其進行生物信息學分析，為深入研究BMIPSP-I基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 采集活體去勢成年（15 月齡）BMI 不育公豬睪丸組織，經(jīng)液氮處理后，置于-80℃超低溫冰箱保存以備RNA 提取。本實驗所用試劑DNA片段回收純化試劑盒購自全式金生物技術有限公司，逆轉(zhuǎn)錄酶XL（AMV）、DL2000、RT-PCR 一步法試劑盒、Competent Cell Preparation Kit、病毒總RNA/DNA 提取試劑盒（TaKaRaMiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、TaKaRa Ex TaqTMTaq 酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司，pMD18-T 克隆載體和大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α購于TaKaRa 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 合成引物 下載GenBank 上豬的PSP-I基因的保守序列（基因登錄號：NM_213837），運用Primer Premier5.0 和Oligo 6 軟件設計1 對特異性引物（F：5′-TCTCCAGGTGGACCCGAAATAT-3′，R：5′-TAGCAG GGAAGACAGGAAAGGC-3′），交上海生工有限公司合成，預計擴增目的片段的大小約為420 bp。

1.2.2 RNA 的提取及cDNA 合成 稱取BMI 睪丸組織樣品約100 mg，依照RNA Plus（TaKaRa）公司相應步驟提取總RNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，以檢測合格的總RNA 為模板，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系：在20 μL 反應體積中，加入2 μg（10 μL）的Total RNA 樣品、1 μL 的Oligo（dT）18（50 μmol/L）和1 μL 的dNTP（10 mmol/L）混合物后，輕輕混勻置于70℃孵育5 min 后，快速放在冰上冷卻；短暫離心后再加入4 μL 的5×first Buffer、2 μL 的DTT（0.1 mol/L）及1 μL 的recombiant RNase inhibitor，輕微吹打混勻，37℃孵育2 min，室溫下加入1 μL的reverse transcriptase M-MLV（200 U/ μL），稍微吹打?qū)⒏鹘M分混勻，37℃孵育10 min，最后53℃將其加熱1 h，94℃反應5 min，終止反應，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PSP-I基因PCR 擴增反應體系與程序 PCR 反應總體系25 μL：1 μL DNA 模板（25 ng/ μL）、12.5 μL Premix Taq（5 U/μL）、上下游引物（10 pmol/μ L）各1 μL，加ddH2O 補足至 25 μL。PCR 擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72℃延伸8 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 PSP-I 基因克隆 采用DNA 純化回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，取一份純化產(chǎn)物送上海生工有限公司直接進行測序，另取一份純化后的目的片段連接到pMD18-T 克隆載體上在 l6℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 再擴增和酶切鑒定后，篩選出陽性菌液送到上海生工生物技術有限公司序列測定。

1.2.5PSP-I基因序列的生物信息學分析 將測序得到的PSP-I基因編碼區(qū)序列采用Generunr 軟件進行比對，人工校對預測出開放閱讀框；利用ExPaSyProtParam程序推測PSP-I基因編碼蛋白分子量、等電點、序列氨基酸的組成、總親水性和穩(wěn)定性；采用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的nucleotide blast 軟件檢驗核苷酸的序列；NetNGlyc 1.0 Server 預測蛋白質(zhì)N-糖基化位點；NetOGlyc 4.0 Server 預測蛋白質(zhì)O-糖基化位點；SignalP 4.1 Server預測信號肽序列；NetPhos 2.0 Server 預測蛋白質(zhì)磷酸化位點；TMpred server 預測跨膜結構域；ExPASy-PrtPram tool 參與編碼蛋白質(zhì)的結構分析；SOPMA 參與蛋白質(zhì)的二級結構預測。

2 結果與分析

2.1PSP-I基因擴增結果 將PSP-I基因進行擴增，特異性片段為420 bp，經(jīng)電泳檢測，目的基因片段大小與預期片段大小一致（圖1）。

2.2PSP-I基因序列分析 登錄http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/，將所得測序結果與GenBank 中下載的豬PSP-I基因序列進行比對，如圖2 所示，有2 處突變位點，分別在第80 bp 和352 bp 處，其中第80 位堿基G 突變?yōu)锳，第352 位堿基A 突變?yōu)镚，將測序結果推導的氨基酸序列與GenBank 中下載的豬PSP-I 蛋白進行比對（圖3），第27 位氨基酸由I（異亮氨酸）突變?yōu)閂（纈氨酸）。

2.3PSP-I基因序列生物信息學分析 用ExPaSyProtParam程序預測PSP-I基因編碼蛋白分子量為8.588 9 ku，理論等電點為8.64；在氨基酸組成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有8 個；堿性氨基酸（Lys+Arg）有10 個；其中亮氨酸（Leu，占12.7%）、絲氨酸（Ser，占11.4%）、甘氨酸（Gly，占11.4%）等含量較高。

PSP-I 蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為34.99，屬于穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為90.00，總的親水性平均系數(shù)（Grand Average Of Hydropathicity，GRAVY）為-0.241，具有疏水性。使用SignalP 4.1 對PSP-I 蛋白進行預測，表明PSP-I 蛋白沒有信號肽位點（圖4）；用NetNGly 1.0進行預測的結果表明，在第17 位有一個N-糖基化位點是NLTC（圖5）。

NetPhos2.0 預測表明，PSP-I 蛋白存在8 個磷酸化位點，其中5 個絲氨酸（Ser）磷酸化位點（A51、A52、A62、A67、A77）、0 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點、3 個酪氨酸（Tyr）活性位點（A7、A24、A69）（圖6）。

用SOPMA 方法預測的PSP-I 蛋白的二級結構如圖7 所示，參與α-螺旋的氨基酸有9 個，含量為11.39%；有30 個氨基酸參與延伸鏈，占37.97%；15個氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占18.99%；25 個氨基酸可能參與無規(guī)則卷曲，占31.65%。以上分析可以推測，無規(guī)則卷曲是PSP-I 蛋白的主要結構。

3 討 論

精子黏附蛋白基因家族是由豬、馬、牛、羊等有蹄類動物生殖道分泌的一類新穎的蛋白家族，能結合磷脂、寡糖、絲氨酸蛋白酶和硫酸多糖的配基發(fā)揮多種功能。其既是精漿蛋白中起重要作用的蛋白，也是占最大比重的蛋白[10]，分子量一般為12.16 ku，呈松散附著在精子細胞表面。該蛋白家族在公豬成熟精子中的mRNA表達豐度很高[13]，在受精過程的各個階段參與精子獲能和頂體反應、調(diào)節(jié)精子活力、在雌性生殖道形成精子庫等多種生物功能[5,14]。公豬精漿中的AQNl、AWN、AQN3、PSP-I、PSP-II 5 個精子黏附蛋白家族成員已被分離鑒定。PSP-I 和PSP Ⅱ是公豬精液中含量最高的蛋白，為公豬生殖道組織特異性蛋白，揭示該基因的表達具有組織特異性。射精后PSP-I 和PSP-II 在精液中形成異二聚體復合物，在公畜生殖道內(nèi)可維持精子穩(wěn)定性，在母畜生殖道內(nèi)可促進精子獲能；在精子冷凍中可修補解凍后損傷的精子膜，提高精子活力。Centurion 等[15]報道PSP-I/PSP-II（純化）二聚體可對高倍稀釋的精子起到保護作用，在生理溫度下可在5 h 內(nèi)保持精子的運動能力、活力和線粒體活性。以上研究表明豬PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白在受精過程中發(fā)揮重要作用，但目前對PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白的研究較少，對于PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白在繁殖育種中所能發(fā)揮的作用缺乏全面的評價。因此，克隆分析PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白具有重要意義。

本研究克隆得到BMI 的PSP-I基因序列長度為420 bp，其核苷酸序列中包含241 bp 的編碼區(qū)和179 bp的非編碼區(qū)，經(jīng)基因序列比對后，編碼區(qū)有1 個堿基發(fā)生突變，其中第80 位堿基G 突變?yōu)锳，將測序結果推導的氨基酸序列與GenBank 中下載的豬PSP-I 蛋白進行比對，第27 位氨基酸由I（異亮氨酸）突變?yōu)閂（纈氨酸）。但這個堿基的突變是否引起PSP-I 蛋白結構和功能發(fā)生改變，從而造成版納微型豬近交系弱精的產(chǎn)生還有待深入研究。

PSP-I 蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定蛋白，具有疏水性。PSP-I蛋白沒有跨膜信號肽位點，在第17 位有1 個N-糖基化位點是NLTC。本實驗中PSP-I 蛋白存在8 個磷酸化位點，其中5 個絲氨酸（Ser）磷酸化位點（A51、A52、A62、A67、A77）、0 個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點、3 個酪氨酸（Tyr）活性位點（A7、A24、A69）。在BMI PSP-I 蛋白序列中只存在3 個潛在的酪氨酸磷酸化位點，推測可能由于酪氨酸磷酸化位點較少，導致對蛋白的修飾和調(diào)控較低，PSP-I 蛋白的活性較弱，才引起B(yǎng)MI 繁殖力低下，具體原因仍需進一步的深入研究。