王建文 ，姚新奎，任萬路，王川坤，褚洪忠，羅鵬輝，閆 睛，孟 軍*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運(yùn)動生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830052；3.新疆伊犁哈薩克自治州畜牧科學(xué)研究所,新疆伊犁 835000；4.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，新疆烏魯木齊 830009）

ACTN3基因是第一個(gè)被證實(shí)的與運(yùn)動能力相關(guān)的重要候選功能基因之一。Myosotis 等[1]通過對意大利優(yōu)秀短跑運(yùn)動員（100～400 m）的研究發(fā)現(xiàn)，ACTN3基因R577X 突變位點(diǎn)未檢測到XX 基因型，表明該突變位點(diǎn)對于速度性能的發(fā)揮可能不利，而更適宜于耐力性運(yùn)動[2]；相關(guān)研究顯示，ACTN3基因R577X 突變位點(diǎn)XX 基因型的個(gè)體達(dá)到呼吸閾及呼吸補(bǔ)償點(diǎn)的速度更快，維持較高速度的運(yùn)動所需運(yùn)動強(qiáng)度也較低[3]，其有氧運(yùn)動能力也更強(qiáng)[4]。

對馬的研究發(fā)現(xiàn)，ACTN3基因多態(tài)性可能與其運(yùn)動性能相關(guān)[5]。國外已對純血馬[6]、法國騎乘馬[7]、夏爾馬[8]、克萊茲代爾馬[8]和阿拉伯馬[9]、巴西運(yùn)動馬[10]等的ACTN3基因多態(tài)性進(jìn)行了相關(guān)研究，均未檢測到與人類似的無義突變。但對澳大利亞5 個(gè)品種馬進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，位于第1 外顯子前端啟動子區(qū)域的突變位點(diǎn)（A1104G）及位于第15 外顯子附近的5 個(gè)內(nèi)含子突變（G9764A、G9773A、G9783A、G9789A 和A9803G）在不同品種馬間存在著顯著差異[8]，且各品種馬用途不同，其中純血馬為優(yōu)秀的速度型品種，而夏爾馬、克萊茲代爾馬則是重挽型品種，這暗示著該基因可能與馬匹的運(yùn)動性能有關(guān)[8]。對阿拉伯馬及巴西運(yùn)動馬的研究也顯示ACTN3基因突變對馬匹調(diào)教訓(xùn)練會產(chǎn)生影響[9-10]。國內(nèi)對蒙古馬[11]、伊犁馬[12]的研究也顯示ACTN3基因可能會對馬匹的運(yùn)動性能產(chǎn)生影響。

焉耆馬為我國優(yōu)良的地方馬品種[13]，具有較好的挽力、速力及持久力[14]，適宜于耐力賽[15-16]。本研究檢測了35 匹參加巴音布魯克耐力賽的焉耆馬ACTN3基因多態(tài)性，通過耐力賽測試馬匹各賽段及全程速度，并分析ACTN3基因突變位點(diǎn)基因型與耐力賽速度之間的關(guān)系，以期篩選適宜于焉耆馬耐力性能的分子輔助標(biāo)記，為耐力賽焉耆馬的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取參加新疆巴音布魯克馬術(shù)耐力賽參賽焉耆馬35 匹為研究對象，實(shí)驗(yàn)馬匹無親緣關(guān)系。所有參賽馬匹通過檸檬酸鈉抗凝管采集左側(cè)頸靜脈血液樣本5 mL，輕微震蕩后通過冰盒帶至實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 耐力性能測定 通過耐力賽測定參賽馬匹的耐力性能。耐力賽總距離為81 km，為保障馬匹福利，根據(jù)國際馬聯(lián)（FEI）關(guān)于耐力賽馬的相關(guān)規(guī)定，將總距離分為3 個(gè)賽段，其中第1 賽段距離為39 km，第2 賽段距離為21 km，第3 賽段距離為21 km，每2 個(gè)賽段之間設(shè)置休息點(diǎn)，參賽馬匹在休息點(diǎn)進(jìn)行休息，測試馬匹心率須在20 min 內(nèi)恢復(fù)至64 bmp，之后方可進(jìn)行下一賽段，每個(gè)賽段記錄參賽馬匹成績。本次耐力賽共有29匹馬完賽，6 匹因心率未在規(guī)定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)至指定范圍而中途退賽。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI 公布的純血馬ACTN3基因序列（序列號： HQ005425），采用Primer-BLAST 對第1、15、20 和21 外顯子進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由于第20 外顯子和第21 外顯子之間距離較?。ㄐ∮?50 bp），因此采用一對引物進(jìn)行擴(kuò)增，共設(shè)計(jì)3 對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR擴(kuò)增 PCR體系25 μL：上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 加至總體積25 μL。采用降落PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，63℃退火45 s，共計(jì)10 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，72℃延伸1 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸10 min。

1.5 基因分型 將所有PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行基因測序，將測序結(jié)果通過DNAStar 軟件進(jìn)行校正，并與公布的純血馬ACTN3基因序列進(jìn)行比對，通過BLAST 分析并確定突變位點(diǎn)及基因型。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 通過Excel 表格進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，計(jì)算各突變位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、群體雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量，并進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)檢驗(yàn)。通過HaploView 4.2 軟件進(jìn)行單倍型構(gòu)建與分析。通過SPSS18.0 軟件對完賽與未完賽馬匹基因型、等位基因頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，通過One-Way ANOVA 法對不同基因型及單倍型組合馬匹各賽段速度、全程速度進(jìn)行方差分析，采用Duncan's 方法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1ACTN3基因測序與分型 通過對3 對引物所擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測序并比對，共計(jì)檢測出8 個(gè)突變位點(diǎn)（圖1），其中第1 個(gè)位于啟動子區(qū)域：A1104G，共檢測出3 種基因型（AA、AG 和GG 基因型）；5 個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)域：G9764A（GG 和AA 基因型）、G9773A（GG、GA 和AA 基因型）、G9783A（GG、GA 和AA 基因型）、G9789A（GG、GA 和AA 基因型）和A9803G（AA、AG 和GG 基因型）；2 個(gè)位于外顯子區(qū)域：C11304T（CC、CT 和TT 基因型）和A11517G（AA、AG 和GG 基因型），且均為同義突變。

2.2 群體遺傳學(xué)分析 由表2 可知，在本研究的焉耆馬中，A1104G、A9803G 和A11517G 位點(diǎn)的優(yōu)勢等位基因?yàn)锳，G9764A、G9773A、G9783A 和G9789A 位點(diǎn)的優(yōu)勢等位基因?yàn)镚，C11304T 位點(diǎn)的優(yōu)勢等位基因?yàn)門。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，A1104G、G9789A 和A11517G突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，其余位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)。由表3 可知，G9773A 突變位點(diǎn)在本研究中為低度多態(tài)（多態(tài)信息含量＜0.25），其余突變位點(diǎn)均為中度多態(tài)（0.25＜多態(tài)信息含量＜0.50）。通過HaploView 4.2 軟件對檢測出的2 個(gè)外顯子突變（C11304T 和A11517G）進(jìn)行單倍型構(gòu)建，共有4 種單倍型，TA、CC、CA、TG 的頻率分別為0.273、0.245、0.241、0.241，TA 為優(yōu)勢單倍型。

表2 焉耆馬ACTN3 基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率

表3 焉耆馬ACTN3 基因多態(tài)位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性

2.3ACTN3基因多態(tài)性與耐力賽速度關(guān)聯(lián)性分析 通過對完賽與未完賽焉耆馬ACTN3基因突變位點(diǎn)基因型及等位基因頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果如表4 所示，在G9764A、G9789A 和C11304T 突變位點(diǎn)基因型頻率呈顯著差異，等位基因頻率呈極顯著差異，其中在未完賽馬匹中G9764A 突變位點(diǎn)不含AA 基因型，G9789A 突變位點(diǎn)不含GG 基因型，C11304T 突變位點(diǎn)不含CC 基因型；在A11517G 突變位點(diǎn)等位基因和基因型頻率均呈極顯著差異，且該位點(diǎn)未完賽馬匹不含AA 基因型。

表4 完賽與未完賽馬匹基因型頻率及等位基因頻率卡方檢驗(yàn)

由表5 可知，G9773A 突變位點(diǎn)AA 基因型在第3賽段速度顯著快于AG 基因型，但與GG 基因型差異不顯著，且第1 賽段、第2 賽段及全程速度3 種基因型之間差異不顯著。G9789A 突變位點(diǎn)AA 基因型第1 賽段速度顯著快于AG 基因型，在第3 賽段GG 基因型速度顯著快于AG 基因型，但在3 個(gè)賽段及全程速度方面AA 基因型與GG 基因型之間差異均不顯著。A9803G突變位點(diǎn)AG 基因型第2 賽段和全程速度快于AA 基因型，AA 基因型與GG 基因型在3 個(gè)賽段及全程速度方面無顯著差異。C11304T 突變位點(diǎn)CC 基因型第1 賽段速度極顯著快于TT 基因型，顯著快于CT 基因型；CC基因型第2 賽段速度極顯著快于CT 基因型和TT 基因型；全程速度方面CC 基因型顯著快于CT 基因型和TT基因型。A11517G 突變位點(diǎn)AA 基因型第1 賽段速度極顯著快于GG 基因型，AG 基因型顯著快于GG 基因型；AA 基因型第2 賽段速度極顯著快于AG 基因型和GG 基因型，AG 基因型速度顯著快于GG 基因型；AA基因型和AG 基因型第3 賽段速度均顯著快于GG 基因型；全程速度方面AA 基因型極顯著快于GG 基因型，AG 基因型顯著快于GG 基因型。

以2 個(gè)外顯子突變位點(diǎn)（C11304T 和A11517G）構(gòu)建的單倍型對完賽馬匹進(jìn)行分組，對不同單倍型組合焉耆馬完賽馬匹耐力賽速度進(jìn)行差異性分析，其中TA/TA 單倍型組合個(gè)體在完賽馬匹中僅檢測出1 匹，故未放入此分析中，結(jié)果如表6 所示，在所有單倍型組合中，CG/CA 和CA/CA 速度最快，且CG/CA 和CA/CA 單倍型組合馬匹第1 賽段、第2 賽段速度及全程速度均極顯著快于TG/TG 單倍型組合，CG/CA 單倍型組合第3賽段速度顯著快于TG/TG 單倍型組合。

3 討 論

ACTN3基因僅在快肌纖維及心肌中表達(dá)[12]，對人的研究結(jié)果顯示，該基因的R577X 位點(diǎn)能發(fā)生無義突變[17-18]，使得編碼577 號氨基酸（精氨酸）的密碼子突變?yōu)榻K止密碼，其中具有純合子XX 基因型的個(gè)體將完全不產(chǎn)生ACTN3 蛋白質(zhì)。對該基因與人運(yùn)動性能的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果顯示R577X 位點(diǎn)X 等位基因?qū)τ谀土π阅苡欣鸞19-21]，ACTN3基因R577X 位點(diǎn)的純合子XX 基因型將導(dǎo)致快肌纖維中缺乏ACTN3 蛋白，使得個(gè)體快速伸縮能力降低，耐力性能提升[22]。對小鼠的研究顯示，當(dāng)ACTN3基因敲除后其ACTN2基因的表達(dá)上調(diào)[23]，但小鼠表現(xiàn)出較野生型小鼠抓地力下降的現(xiàn)象，其耐力性能測試顯示基因敲除小鼠在竭力運(yùn)動中所跑動距離更長[24]；小鼠的運(yùn)動訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型小鼠力竭運(yùn)動距離為未經(jīng)訓(xùn)練野生型小鼠的2 倍，而基因敲除小鼠訓(xùn)練后的力竭運(yùn)動距離為未經(jīng)訓(xùn)練基因敲除小鼠的3.3 倍[25]。

表5 焉耆馬ACTN3 基因多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與耐力賽速度的關(guān)聯(lián)分析 km/h

表6 焉耆馬ACTN3 基因不同單倍型組合與耐力賽速度的關(guān)聯(lián)分析 km/h

對純血馬[6]、法國騎乘馬[7]和夏爾馬[8]的研究結(jié)果顯示，在第1 外顯子前端的啟動子區(qū)域有1 個(gè)突變位點(diǎn)（A1104G），在第15 外顯子附近有5 個(gè)內(nèi)含子突變，在第20 和第21 外顯子分別具有1 個(gè)同義突變。本研究在焉耆馬中共檢測出8 個(gè)突變位點(diǎn)，各突變位點(diǎn)與前人研究結(jié)果一致[8]。χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明A1104G、G9789A和A11517G 突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，而其余突變位點(diǎn)則處于Hardy-Weinberg 不平衡狀態(tài)，這主要是因?yàn)樵诒敬螌?shí)驗(yàn)采樣過程中，所采集血樣的焉耆馬均為參加比賽馬匹，這些馬匹在參賽之前的挑選均有著較大的人為干預(yù)因素，由此造成馬匹采樣出現(xiàn)了非隨機(jī)性，從而使得本次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了較多位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)[26-27]；同時(shí)也可能是由于本實(shí)驗(yàn)所采集馬匹的樣本量較小或由于所檢測突變位點(diǎn)大部分為中度多態(tài)位點(diǎn)，這些都可能造成平衡狀態(tài)被打破[28]。本研究顯示，除G9773A 突變位點(diǎn)外，其余各突變位點(diǎn)均處于中度多態(tài)位點(diǎn)，表明這些中度多態(tài)位點(diǎn)具有較高的選擇潛力[29]，可以在今后的育種過程中加以利用。

本研究中，對完賽與未完賽焉耆馬的基因型頻率及等位基因頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，G9764A、G9789A、C11304T 和A11517G 突變位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在2 組馬匹之間呈現(xiàn)顯著差異性，這暗示著這些突變位點(diǎn)可能會通過影響馬匹力竭運(yùn)動距離來影響馬匹的耐力性能。

對各突變位點(diǎn)與焉耆馬耐力賽速度進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示，在所檢測到的外顯子突變中，C11304T 和A11517G 突變位點(diǎn)均會影響到焉耆馬的耐力速度性能，其中在C11304T 突變位點(diǎn)表現(xiàn)出CC 基因型第1 賽段、第2 賽段及全程速度均顯著或極顯著高于TT 基因型，這表明該突變位點(diǎn)CC 基因型更適宜于焉耆馬耐力賽；A11517G 突變位點(diǎn)則表現(xiàn)出AA 基因型在所測各階段速度均顯著或極顯著高于GG 基因型，這表明A11517G 突變位點(diǎn)的AA 基因型更適宜于焉耆馬耐力賽；單倍型分析結(jié)果顯示這2 個(gè)突變位點(diǎn)的優(yōu)選組合為CG/CA 和CA/CA 基因型。雖然這2 個(gè)突變位點(diǎn)均為同義突變，并不會造成在基因表達(dá)過程中的氨基酸改變，但這些突變位點(diǎn)可能會與其他突變位點(diǎn)共同作用，從而對運(yùn)動產(chǎn)生影響；也可能與其他上下游相關(guān)基因或者與ACTN3基因關(guān)聯(lián)作用的基因（如ACTN2等）進(jìn)行連鎖，從而通過信號傳導(dǎo)等機(jī)制對馬匹的運(yùn)動性能產(chǎn)生影響[30]。根據(jù)對人及基因敲除小鼠的研究，當(dāng)該基因不表達(dá)時(shí)會對運(yùn)動產(chǎn)生影響，對馬的研究結(jié)果也顯示調(diào)教訓(xùn)練會使得該基因的表達(dá)發(fā)生改變[9]，提示該基因的表達(dá)可能會影響到馬匹的運(yùn)動性能。相關(guān)研究結(jié)果也顯示，人工選擇等因素影響會造成部分物種對密碼子的使用產(chǎn)生一定的偏好性，而這種偏好性將會影響到基因的表達(dá)[31]，同時(shí)同義突變也會對蛋白質(zhì)的翻譯效率產(chǎn)生影響[32]；這也可能是這2 個(gè)突變位點(diǎn)影響到焉耆馬耐力性能的原因，但具體影響機(jī)制還有待更加深入的研究。由于耐力賽參賽馬匹相對較少，該研究結(jié)果（顯著性SNP 及單倍型）尚有待于大樣本量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，焉耆馬ACTN3基因與耐力賽速度相關(guān)，其中C11304T 和A11517G 突變位點(diǎn)對其全程速度有著顯著影響，主要表現(xiàn)為CC 基因型和AA 基因型顯著或極顯著高于其余2 種基因型，單倍型組合中CG/CA 和CA/CA 基因型為優(yōu)選基因型組合，因此可將C11304T 和A11517G 突變位點(diǎn)作為焉耆馬耐力賽速度性能的候選分子輔助標(biāo)記之一。

致謝：本研究在采樣過程中得到了巴音布魯克馬術(shù)耐力賽組委會的大力支持，謹(jǐn)此致謝！