俞少博，王佳堃

（浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

微生態(tài)制劑（Direct Fed Microbials）是一類無致病性，可直接飼喂，且其本身或者其代謝產(chǎn)物對動物機體有積極調(diào)控作用的活性微生物[1]。然而，微生態(tài)制劑進入瘤胃后，多數(shù)情況下無法在瘤胃中有效定植并與已經(jīng)占據(jù)優(yōu)勢地位的瘤胃原住微生物共存，發(fā)揮其益生效果[2-3]。而反芻動物在斷奶過程中，瘤胃微生物功能和種類均發(fā)生顯著變化[4-5]。在快速變化的微生物區(qū)系中，相對脆弱的相互關(guān)系使得外源微生物更易于定植[6]。Dommels 等[7]研究表明，微生態(tài)制劑在幼齡反芻動物胃腸道內(nèi)有效定植并保持代謝活力是其發(fā)揮作用的前提。Signorini 等[8]的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，給犢牛喂食全乳的過程中添加混合產(chǎn)乳酸菌制劑或單菌均有一定的益生效果，這證實幼齡期是微生態(tài)制劑干預(yù)的適宜期；但該分析也發(fā)現(xiàn)，斷奶期犢牛只喂食代乳料的條件下，無論是添加單菌還是混菌都沒有顯著的益生效果，因此微生態(tài)制劑在幼齡期的應(yīng)用同樣存在限制因素。為提高微生態(tài)制劑的調(diào)控效果，本文主要綜述近十年來微生態(tài)制劑在幼齡反芻動物中的應(yīng)用現(xiàn)狀，分析微生態(tài)制劑發(fā)揮作用的條件及影響其定植的因素，以新型微生態(tài)制劑的研發(fā)成果為基礎(chǔ)，探討基因工程技術(shù)引入特定底物或者群體響應(yīng)通路相關(guān)基因提高微生態(tài)制劑應(yīng)用效果的可行性。

1 微生態(tài)制劑對反芻動物斷奶前后生產(chǎn)性能的影響及作用機制探討

1.1 飼喂微生態(tài)制劑對幼齡反芻動物斷奶前后生產(chǎn)性能的影響 反芻動物斷奶前后，可供飼喂的微生態(tài)制劑主要有乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母以及乳酸利用菌等單菌制劑，以及按一定比例混合形成的混菌制劑或添加寡糖底物后形成的合生制劑（表1）[9-16]。飼喂微生態(tài)制劑不同程度地提高了幼齡反芻動物斷奶前后的日增重和飼料效率，降低了腹瀉發(fā)生率，并能提高動物個體的采食量等指標。隨著相關(guān)研究的進一步深入，微生態(tài)制劑的可能作用機制也被逐漸揭示。

1.2 飼喂微生態(tài)制劑可能提高幼齡反芻動物開食料的利用率 開食料不同于液體飼料，其中含有大量的植物多糖類化合物，如淀粉、纖維素等。Rey 等[17]在犢牛出生后第2 天，就在瘤胃內(nèi)容物中檢測出木聚糖酶和淀粉酶活性，而其瘤胃發(fā)酵能力依然低于出生后2 個月的犢牛，微生態(tài)制劑仍可能通過促進飼料消化來提高犢牛的生產(chǎn)性能。張志焱等[18]研究發(fā)現(xiàn)在羔羊日糧中添加0.1%商用復(fù)合微生態(tài)制劑（芽孢桿菌、乳酸菌和酵母混合）可以有效提高羔羊斷奶后有機物、粗蛋白質(zhì)和酸性洗滌纖維的消化率。然而，Ishaq 等[19]給剛出生的羔羊直接飼喂分離自美洲麋鹿瘤胃的纖維利用菌（Bacillusspp.和Staphylococcus saprophyticus bovis等），羔羊纖維物質(zhì)的消化能力并未提高，只提高了飼料轉(zhuǎn)化效率。不同于促進飼料原料降解的微生態(tài)制劑，部分微生態(tài)制劑則針對瘤胃中二級產(chǎn)物的利用，如乳酸、琥珀酸等。這類二級產(chǎn)物是丙酸生成的主要前體物質(zhì)，添加利用這些二級產(chǎn)物的微生物可能促進瘤胃丙酸生成[20]。Stein 等[21]給圍產(chǎn)期和泌乳早期奶牛添加埃氏巨球菌（Megasphaera elsdenii）后，奶牛瘤胃中乳酸生成丙酸的效率增加，能量供應(yīng)效率提升。但關(guān)于這類乳酸利用菌在反芻動物斷奶過程中的應(yīng)用研究較少，而反芻動物的斷奶過程往往面臨著與圍產(chǎn)期相同的能量負平衡問題，添加埃氏巨球菌等乳酸利用菌來有效利用開食料發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸轉(zhuǎn)化成丙酸，可能有助于提高肝臟的糖異生過程，緩解能量負平衡。

表1 幼齡反芻動物常用的微生態(tài)制劑類型

1.3 微生態(tài)制劑影響瘤胃中其他功能微生物定植 微生物在幼齡反芻動物瘤胃中的定植是一個復(fù)雜的過程，先定植的微生物可能通過消耗氧氣、產(chǎn)生二級產(chǎn)物等方式改變現(xiàn)有的瘤胃內(nèi)環(huán)境來影響后續(xù)其他微生物的定植[4-5]。微生態(tài)制劑可能通過這種方式發(fā)揮其對幼齡反芻動物的益生作用。釀酒酵母類微生態(tài)制劑能夠有效降低瘤胃液的含氧量，從而加快厭氧微生物的定植[22]。0.1%屎腸球菌（Enterococcus faeciumSROD）活菌制劑能夠提高體外產(chǎn)氣體系中總菌、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）的數(shù)量[23]。同時添加布拉迪酵母（Saccharomycescerevisiae boulardiiCNCM I-1079）和嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilusBT1386）能夠提高犢牛瘤胃中絲狀桿菌屬（Fibrobacter）的相對豐度，而單獨添加布拉迪酵母能夠提高瘤胃中歐陸森氏菌屬（Olsenella）等有益菌的相對豐度[24]。微生態(tài)制劑改變幼齡反芻動物消化道微生物的組成，從而提高其斷奶前后的生產(chǎn)性能。不僅如此，通過采用微生態(tài)制劑對幼齡時期反芻動物進行調(diào)控，甚至可能對反芻動物產(chǎn)生長期的作用效果，這為提高成年反芻動物的生產(chǎn)性能提了新的思路。

1.4 飼喂微生態(tài)制劑降低腸道病原菌豐度 由于對外界病源菌的抵抗力較弱，病源菌感染導(dǎo)致的腹瀉是幼齡反芻動物出生后面臨的主要挑戰(zhàn)之一，導(dǎo)致腹瀉的病原菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌以及梭狀桿菌等。腹瀉會造成營養(yǎng)物質(zhì)的消化不良，嚴重的可能導(dǎo)致幼畜死亡[25]。微生態(tài)制劑可能降低宿主腸道病原菌的豐度并降低腹瀉發(fā)生率。體外抑菌試驗證實，牛瘤胃源的海氏腸球菌（Enterococcus hirae）能夠有效抑制大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosaATCC 27853）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhiMTCC 1254）、霍亂弧菌（Vibrio choleraMTCC 3906）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogensMTCC 111）的生長[26]；牛糞源的乳酸菌（Lactobacillus salivariusC86 和Lactobacillus amylovorusC94）能夠有效抑制沙門氏菌（Salmonella entericaspp.）的生長[27]。羔羊的體內(nèi)試驗證實，糞鏈球菌（Streptococcus faecium）單菌制劑，以及糞鏈球菌和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的混合制劑可以有效降低大腸桿菌O157：H7（Escherichia coliO157:H7）攻毒羔羊糞便中致病菌的數(shù)量[28]；犢牛的體內(nèi)試驗同樣發(fā)現(xiàn)，飼喂乳酸桿菌（Lactobacillusspp.）和芽孢桿菌（Bacillusspp.）混菌制劑的抗腹瀉效果優(yōu)于同期試驗的抗生素組，因此微生態(tài)制劑可能作為抗生素替代物應(yīng)用于反芻動物生產(chǎn)[29]。病原菌感染會引起幼齡反芻動物的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，從而影響共生微生物與宿主的相互關(guān)系。微生態(tài)制劑的免疫調(diào)節(jié)作用可能成為后續(xù)菌-宿主相互關(guān)系研究的重要手段。

2 影響微生物定植及其作用效果的可能因素

2.1 幼齡反芻動物的瘤胃環(huán)境 反芻動物在斷奶過程中，瘤胃微生物逐漸從以消化簡單碳水化合物為主，過渡到以消化復(fù)合碳水化合物為主，定植的主要類群則從兼性厭氧菌轉(zhuǎn)變?yōu)閲栏駞捬蹙鶾4-5]。因此，越來越多的研究者認為幼齡反芻動物的胃腸道微生物區(qū)系相對簡單，提供了一個合適的調(diào)控窗口期[6]。但表1 中的微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果并不一致。近期Yohe 等[30]報道，犢牛出生后口服埃氏巨球菌制劑并不能使這一微生物在犢牛瘤胃中成功定植，從而不能發(fā)揮預(yù)想的作用。因此，微生態(tài)制劑中的微生物進入幼齡反芻動物的瘤胃之后如何生存、面臨什么樣的競爭、是否會隨著大量的液體飼料被排出等未知的可能性都可能決定該微生物能否在瘤胃中有效定植。而相關(guān)的研究甚少且仍處于起步階段。此外，幼齡反芻動物出生后不久沒有開始攝入固體飼料，瘤胃中缺乏微生物定植所需要的底物條件，而測序的結(jié)果顯示，出生后極短的時間內(nèi)，部分纖維利用菌即在瘤胃中定植[31]。幼齡反芻動物瘤胃中底物的缺乏和其他早期定植微生物的競爭同樣可能對具有相似功能的外源微生物的定植產(chǎn)生阻礙，這與原先所設(shè)想的有別于成年瘤胃系統(tǒng)的一種菌群組成相對簡單、可塑性強的環(huán)境不完全符合。因此，進行微生態(tài)制劑干預(yù)的時間點尤其重要，既要保證足夠的飼料底物供應(yīng)，又要保證相對簡單的瘤胃微生物組成，這可能是后續(xù)研究的關(guān)鍵。

2.2 微生態(tài)制劑的自身特性 微生物生態(tài)學(xué)中，環(huán)境中可利用的剩余資源和微生物與周圍環(huán)境及其他微生物之間的相互關(guān)系共同決定該微生物能否在進入新環(huán)境之后生存[32]。結(jié)合人類腸道中的相關(guān)研究，如何選擇合適種類的微生態(tài)制劑可能決定了該微生態(tài)制劑能否在幼齡反芻動物的胃腸道中成功定植并發(fā)揮作用（表2）。研究者們在使用微生態(tài)制劑進行早期調(diào)控時應(yīng)盡可能考慮受體動物的胃腸道環(huán)境條件、微生態(tài)制劑的來源（供體動物）、制劑菌種之間的相互關(guān)系以及微生態(tài)制劑的環(huán)境適應(yīng)性等不同因素，根據(jù)已知條件選擇合適的微生態(tài)制劑從而提高其作用的發(fā)揮效率。

3 使用特殊微生物及其制劑提高活性微生物定植概率和作用效果

3.1 底物定量調(diào)控 利用底物調(diào)控微生物在動物胃腸道內(nèi)的豐度可能是一種快速有效的調(diào)控方式。寡糖類化合物與微生物聯(lián)合制備的合生制劑可成功讓芽孢桿菌在犢牛腸道中定植49 d[38]。采用一種小鼠腸道中不存在的“紫菜多糖”，與編碼該多糖降解基因的工程擬桿菌（Bacteroides plebeiusDSM 17135）聯(lián)合，研究者成功地通過胃腸道中紫菜多糖的濃度調(diào)控了該工程擬桿菌在小鼠腸道中的豐度[34]。而且相比于長期飼喂含紫菜多糖的飼料，間歇性飼喂更能讓該工程擬桿菌在小鼠腸道中長期定植[39]。隨著酶工程技術(shù)的發(fā)展，通過在已有的微生物菌株上編碼特定的底物利用基因，從而提高微生物的競爭能力已經(jīng)成為可能，但這些特種工程菌在反芻動物中的研究應(yīng)用還較少。在口服引入新型微生態(tài)制劑的同時，適當添加一些僅被目標微生物利用的底物或者間歇性飼喂含有這一底物的飼料，可以有效提高微生物進入胃腸道之后的競爭力，從而提高成功定植的概率。

表2 生態(tài)學(xué)概念、影響微生態(tài)制劑定植的可能因素及潛在微生態(tài)制劑的選擇

3.2 群體響應(yīng)（Quorum Sensing）調(diào)控 群體響應(yīng)是微生物的重要生長機制，并與生物膜的形成息息相關(guān)，其通過一系列信號分子的傳導(dǎo)，刺激下游基因的表達，同時產(chǎn)生更多的信號分子，形成鏈式反應(yīng)，繼續(xù)刺激更多的微生物增殖，其中信號分子主要包括高絲氨酸內(nèi)酯類化合物以及乳酸鏈球菌素（Nisin 和Lactococcin A）等細菌素[40]。在早期試驗中，研究者檢測到體外培養(yǎng)的瘤胃微生物（如溶纖維丁酸弧菌和普雷沃式菌屬）的培養(yǎng)物中存在AI-2（Autoinducer-2）群體響應(yīng)的信號分子，其中普雷沃式菌中也檢測到S-核糖高半胱氨酸裂解酶基因（luxS）的同源基因序列[41]。然而，近期在山羊瘤胃的體內(nèi)試驗中卻無法檢測到相關(guān)的活性信號分子，只能檢測到luxS的同源基因[42]。盡管瘤胃內(nèi)天然存在的群體響應(yīng)需要后續(xù)的試驗進一步驗證，但是相關(guān)基因的存在至少能夠說明群體響應(yīng)在瘤胃微生物的相互關(guān)系中發(fā)揮一定的作用。Kong 等[43]通過在乳酸菌中編碼轉(zhuǎn)入完整的Nisin 增殖信號通路，可以讓微生物的鏈式反應(yīng)促進下游同種微生物的增殖，大大增加乳酸菌的生長速度；而且用同樣的方法在體外構(gòu)建的代表多種菌-菌互作關(guān)系的不同類型的工程菌，可用于構(gòu)建特殊的微生物群體并進行整體移植來提高定植的效率。而Miyazaki 等[44]報道了一些病原菌也會通過群體響應(yīng)來形成生物膜而感染機體，部分乳酸菌的引入也可能會產(chǎn)生信號分子，意外地促進大腸桿菌等病原菌的生物膜形成，這反而不利于發(fā)揮所預(yù)想的益生作用。針對這種情況，Zhou 等[45]在魚腸引入能夠產(chǎn)生降解對應(yīng)信號分子的酶的微生物來終止群體響應(yīng)，最終抑制病原菌的增殖。飼喂特定的微生物，同時外源添加群體響應(yīng)的信號分子促進有益微生物的增殖，這類微生態(tài)制劑可能在反芻動物生產(chǎn)中具有特殊的應(yīng)用價值。但是在使用過程中選擇合適的信號通路及信號分子對于能否實現(xiàn)既定效果至關(guān)重要，亟待后續(xù)研究者針對反芻動物胃腸道中存在的群體響應(yīng)機制進行研究。

3.3 瘤胃微生物移植 相比于外源微生物，原本來自于瘤胃中的微生物理論上更適合在同一物種的瘤胃中定植，因此將成年反芻動物的瘤胃液移植給同種幼齡動物是一種非常直接且高效的試驗方法。在羔羊出生后28 d開始口腔灌服新鮮或者凍干后的母羊瘤胃液都能顯著提高移植后羔羊1 周和28～84 日齡的平均日增重[36]。而在犢牛的試驗中，灌服新鮮、凍干、高壓滅菌或者離心之后的瘤胃上清液都能降低犢牛的腹瀉率[46]。不僅如此，成年動物的瘤胃也是一個高效的訓(xùn)練發(fā)酵固體飼料的微生物容器，通過在供體的飼料中添加與開食料相同的飼料原料，在受體羔羊飼喂開食料的同時，移植來自供體羊的瘤胃液，可能是一種更有效的瘤胃微生物移植方法[47]。然而，盡管在表觀上觀測到了瘤胃微生物移植的積極作用，但是移植物中殘余的細胞組分、揮發(fā)性脂肪酸等都會對最終結(jié)果的解釋造成偏差，研究者還未完全確定這些瘤胃液移植物中具體哪一類微生物能被成功移植進入受體的瘤胃中定植并發(fā)揮作用。來自供體的“成熟”瘤胃液作為一種復(fù)雜的微生態(tài)制劑，其中存在著許多成年瘤胃微生物區(qū)系所包含的菌-菌互作關(guān)系，配合開食料的采食，瘤胃中的微生物定植過程可能會被“重新定向”，具有巨大的研究和應(yīng)用價值。

4 小 結(jié)

口服微生態(tài)制劑是調(diào)控反芻動物胃腸道微生物的重要手段，雖然某些微生態(tài)制劑可以有效提高反芻動物的生產(chǎn)性能并降低健康風(fēng)險，但無效的應(yīng)用結(jié)果也層出不窮，有些即使有效也并不持久?？傮w上，微生態(tài)制劑在幼齡反芻動物中的應(yīng)用效果優(yōu)于成年反芻動物，但是也存在調(diào)控后無效的可能性。微生物在胃腸道中成功定植與否是其發(fā)揮作用的首要前提，而定植受到宿主基因、底物等多種因素的影響。關(guān)于活性微生物在幼齡反芻動物胃腸道中定植的情況，國內(nèi)外的研究較少，因此，需要后續(xù)的研究者針對幾個關(guān)鍵方向展開研究：①活性微生物進入幼齡反芻動物瘤胃后的豐度變化過程；②幼齡反芻動物瘤胃內(nèi)可利用底物與活性微生物的相互關(guān)系；③瘤胃微生物與外源活性微生物之間的互作。隨著這些關(guān)鍵的研究基礎(chǔ)越來越扎實，可以有效結(jié)合生態(tài)學(xué)理論，根據(jù)不同的受體特性及其胃腸道環(huán)境條件設(shè)計不同功能的工程益生菌，并通過相應(yīng)的手段調(diào)控微生物的增殖，從而提高微生態(tài)制劑的調(diào)控效果，最終為生產(chǎn)者提供切實有效的微生態(tài)制劑產(chǎn)品。