任玉文 任媛媛 劉雅禎 盧天華 劉力強(qiáng) 周曉輝

摘 要：為提高菌體產(chǎn)量，以益生菌枯草芽孢桿菌Asr作為發(fā)酵菌株，采用正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法，對(duì)枯草芽孢桿菌Asr的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明，影響菌體產(chǎn)量最主要的3個(gè)因素為酵母浸粉、MgSO4和CaCl2;最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉8.65 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L;最佳培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、初始pH值7.0、接種量10%、攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min;應(yīng)用優(yōu)化配方及工藝，枯草芽孢桿菌Asr的最高產(chǎn)量達(dá)到7.30×108 cfu/mL，菌體產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了3.95倍。研究結(jié)果可為后續(xù)菌體發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)提供技術(shù)支撐，對(duì)其他枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵工程;枯草芽孢桿菌;發(fā)酵工藝;正交法;響應(yīng)面法;優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS2021 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? doi：10.7535/hbkd.2020yx05007

Abstract：In order to increase yield，take the Bacillus subtilis Asr as the expreession strain， the fermentation process of Bacillus subtilis Asr was optimized by orthogonal test and response surface method. The results show that three main factors affecting bacterial yield are leaching yeast powder， MgSO4 and CaCl2. The best fermentation medium formulation is as following： sucrose 20 g/L， peptone 10 g/L， leaching yeast powder 8.65 g/L， K2HPO4 3.0 g/L， MgSO4 0.27 g/L and CaCl2 0.53 g/L. The optimal culture conditions are as following： 37 ℃， initial pH 7.0， inoculum of 10% and stirring speed of 250 r/min. After the optimization， the highest yield of Bacillus subtilis Asr reaches 7.30×108 cfu/mL， which is 3.95 times higher than that before optimization. The study provides a technical reference for the subsequent bacterial scale-up culture in fermentor and the optimization of fermentation medium from other Bacillus subtilis.

Keywords：fermentation engineering; Bacillus subtilis; fermentation process; orthogonal method; response surface method; optimization

植物軟腐病是由果膠桿菌屬細(xì)菌引起的植物病害，侵染植物組織或器官，對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大危害[1]，近年來(lái)由植物軟腐病造成的農(nóng)業(yè)損失數(shù)不勝數(shù)。如廣東省的香蕉軟腐病，最高發(fā)病率可達(dá)50%[2];北京通州地區(qū)2.5×107 m2的芹菜軟腐病，使植株整體腐爛死亡，造成絕產(chǎn)[3];河北暴發(fā)的黃瓜軟腐病，區(qū)域發(fā)病率最高可達(dá)到50%，產(chǎn)量損失嚴(yán)重[4]。目前對(duì)植物軟腐病的防治方法有合理輪作、避免機(jī)械損傷、噴灑農(nóng)藥或植物水提液[5-8]等，這些方法不僅增加了人力消耗，還會(huì)造成環(huán)境污染、危害人體健康。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtlis）系芽孢桿菌屬的一種，廣泛分布于土壤及腐敗的有機(jī)物中，適宜在枯草浸泡液中繁殖[9-12]?？莶菅挎邨U菌是一種優(yōu)良的生防菌和食品級(jí)益生菌[13-14]，具有很強(qiáng)的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活性，代謝旺盛，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，在食品、飼料和農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用廣泛[15-17]。在其生長(zhǎng)過(guò)程中分泌細(xì)菌素、脂肽類化合物、有機(jī)酸類物質(zhì)等，可有效抑制病原菌的生長(zhǎng)或溶解病原菌[18]，因此在天然食品防腐和田間防治等方面[19]具有十分重要的意義。

在食品研究領(lǐng)域中，可通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高枯草芽孢桿菌野生型菌株產(chǎn)酶或抗菌肽的能力[20-24]。本研究所用的枯草芽孢桿菌Asr，能夠表達(dá)CpxP蛋白。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，CpxP蛋白對(duì)含有軟腐病胡蘿卜的抑菌率達(dá)到44.89%，對(duì)馬鈴薯切片的抑菌率達(dá)到59.41%[25]?？莶菅挎邨U菌Asr是將益生菌和抗菌蛋白進(jìn)行協(xié)同作用，代替化學(xué)農(nóng)藥，有效抑制植物軟腐病的發(fā)生，符合“健康食品、綠色食品”的生活理念。

目前有關(guān)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究有很多[26-27]。用這些培養(yǎng)基發(fā)酵枯草芽孢桿菌Asr，菌體產(chǎn)量偏低，最高產(chǎn)量?jī)H為1.85×108 cfu/mL。本文以枯草芽孢桿菌Asr作為發(fā)酵菌株，通過(guò)對(duì)既定的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行正交試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，以O(shè)D600值作為最終響應(yīng)結(jié)果，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。基于最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在3 L小型發(fā)酵罐中通過(guò)單因素試驗(yàn)探究最佳發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量及攪拌轉(zhuǎn)速，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，以提高發(fā)酵液中的菌體密度，為其應(yīng)用于食品業(yè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Asr：河北科技大學(xué)蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑及儀器

蔗糖：天津市百世化工有限公司;蛋白胨、酵母浸粉：北京市奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;磷酸氫二鉀（K2HPO4）：天津市鼎盛鑫化工有限公司;氯化鈉（NaCl）：天津市永晟精細(xì)化工有限公司;硫酸鎂（MgSO4）：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

電子天平T1000：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;分析天平ME104/02：梅特勒-托利多（上海）有限公司;電子pH計(jì)STARTER3100/F：奧豪斯（上海）有限公司;磁力攪拌器HJ-4AS：江蘇省金壇市榮華儀器公司;移液器：大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司;冰箱BCD-189WDPV：海爾公司;超低溫冷凍儲(chǔ)存箱DW-HL100：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司;單人單面垂直凈化工作臺(tái)SW-CJ-1FD、立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-30SII：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫培養(yǎng)振蕩器ZWYR-4912：上海智城分析儀器制造有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-5800（PC）：上海元析儀器有限公司;顯微鏡BA410E：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;3 L 5BG發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

平板瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，pH值7.0 g/L，121 ℃條件下滅菌20 min。種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃條件下滅菌20 min。原始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，K2HPO4 30 g/L，CaCl2 030 g/L，MgSO4 050 g/L，pH值7.0，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)條件

平板培養(yǎng)條件：從-80 ℃ 冰箱取出保藏菌株，在固體平板上劃線進(jìn)行菌株活化，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件：挑取平板上的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，裝液量50 mL/250 mL，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)16 h。發(fā)酵培養(yǎng)條件：按5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）接種量將種子液接種到裝液量50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

取穩(wěn)定期菌液，原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD600值。將菌液稀釋到合適倍數(shù)后涂布到平板瓊脂培養(yǎng)基上，計(jì)算活菌數(shù)。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將培養(yǎng)好的種子液，按5%的接種量接種于50 mL/250 mL的錐形瓶中，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)。接種后每2 h取樣1次，測(cè)定菌液的OD600值，以未接種種子液的發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.2.4 6因素2水平正交試驗(yàn)

根據(jù)原始發(fā)酵培養(yǎng)基選擇6個(gè)因素：蔗糖，蛋白胨，酵母浸粉，K2HPO4，MgSO4和CaCl2，進(jìn)行6因素2水平正交試驗(yàn)。依據(jù)OD600值，做3個(gè)平行，通過(guò)極差大小進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定最優(yōu)因素水平組合。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)6因素2水平正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇極差最大的3種因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（Box-Behnken），如表1所示。試驗(yàn)重復(fù)3次，以O(shè)D600值為響應(yīng)值，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在優(yōu)化培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，分別對(duì)枯草芽孢桿菌Asr的培養(yǎng)溫度（28，31，34，37，40 ℃）、初始pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）、接種量（1%，3%，5%，10%，15%）、攪拌轉(zhuǎn)速（100，150，200，250，300 r/min）4個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行3 L小型發(fā)酵罐單因素優(yōu)化試驗(yàn)[28]，發(fā)酵時(shí)間為14 h，以O(shè)D600值和活菌數(shù)作為分析參考依據(jù)。

2 結(jié)果分析

菌株在原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知，在0～2 h處于生長(zhǎng)延滯期，菌體密度小;2～12 h處于生長(zhǎng)指數(shù)期，菌體密度上升極快，菌體數(shù)量急劇增多;在12 h時(shí)達(dá)到峰值;12～24 h處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌群數(shù)量維持穩(wěn)定。因此選取12 h作為正交試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)的測(cè)試時(shí)間，此時(shí)枯草芽孢桿菌為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，既可以保持高的細(xì)胞活力，又可以獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。

2.2 6因素2水平正交試驗(yàn)結(jié)果分析

6因素2水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析如表2所示，正交試驗(yàn)方差分析如表3所示。根據(jù)極差分析結(jié)果，各因素對(duì)OD600值的影響順序依次是：酵母浸粉>MgSO4>CaCl2>蔗糖>K2HPO4>蛋白胨;根據(jù)方差分析，酵母浸粉，MgSO4，CaCl2對(duì)OD600值具有顯著影響?？梢苑謩e選擇蔗糖、K2HPO4、蛋白胨的最好水平，即蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO4 3 g/L，通過(guò)響應(yīng)面法重點(diǎn)考察酵母浸粉、CaCl2和MgSO4 3個(gè)主要因素對(duì)菌株的影響。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

利用響應(yīng)面軟件（Design Expert 8.0）中的Box-Behnken設(shè)計(jì)以酵母浸粉、MgSO4和CaCl2 3個(gè)因素為自變量的試驗(yàn)，將OD600值作為響應(yīng)值，共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為2類：一類是中心試驗(yàn)點(diǎn)，中心試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)5次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差[29-31];另一類是非中心試驗(yàn)點(diǎn)，共12個(gè)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，酵母浸粉和MgSO4對(duì)OD600值均具有顯著影響（P<0.05），回歸模型P值<0.01，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)的P值>0.05，為不顯著水平。說(shuō)明所構(gòu)建的回歸模型顯著，能夠真實(shí)反映試驗(yàn)情況。決定系數(shù)R2=0.963 5，修正決定系數(shù)R2=0.916 6>0.900 0，說(shuō)明回歸模擬程度好。

為進(jìn)一步研究相關(guān)變量因素之間的交互作用，確定最優(yōu)點(diǎn)，利用軟件分析二次回歸模型，繪制了3個(gè)影響因素之間的響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖，如圖2所示。圖2中等高線均呈橢圓形，表明各因素的交互作用顯著[32]，同時(shí)得到最佳培養(yǎng)基配方為酵母浸粉8.65 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L。經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，OD600值達(dá)到4.18，相比培養(yǎng)基優(yōu)化前，提高了17%;菌數(shù)平均數(shù)從1.85×108 cfu/mL提高到3.25×108 cfu/mL，提高到培養(yǎng)基優(yōu)化前的1.76倍。

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)量的影響

低溫和高溫對(duì)枯草芽孢桿菌Asr的生長(zhǎng)均有不同程度的影響，溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)延遲枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)，降低生物合成量。在28～40 ℃溫度范圍內(nèi)，出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)，37 ℃時(shí)OD600值最大（見(jiàn)圖3 a））。因此枯草芽孢桿菌Asr的最適宜發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.4.2 不同初始pH值對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)量的影響

初始pH值高呈堿性，會(huì)破壞枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜的電荷，從而降低枯草芽孢桿菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及利用率;pH值低呈酸性，會(huì)降低菌體細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性[31]。初始pH值為7.0時(shí)，與其他初始pH值組D600值存在較大差異;當(dāng)培養(yǎng)液初始pH值為7.5時(shí)，發(fā)酵液OD600值開始顯著下降（見(jiàn)圖3 b））。因此，枯草芽孢桿菌Asr最適宜初始pH值為7.0。

2.4.3 不同接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)量的影響

枯草芽孢桿菌接種量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中初始菌濃度偏高，減小菌體擴(kuò)增倍數(shù)，抑制菌體代謝生長(zhǎng)，還會(huì)導(dǎo)致菌體溶氧量的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，降低菌體活性和生產(chǎn)效益;接種量過(guò)小，則會(huì)降低單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)量[33];當(dāng)接種量為10%時(shí)，OD600值最大（見(jiàn)圖3 c））。因此得出，枯草芽孢桿菌Asr最適宜接種量為10%。

2.4.4 不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)量的影響

攪拌轉(zhuǎn)速的主要作用是調(diào)節(jié)培養(yǎng)基溶氧量，滿足枯草芽孢桿菌對(duì)氧氣的需求。轉(zhuǎn)速過(guò)快會(huì)造成培養(yǎng)基分層，對(duì)菌體產(chǎn)生機(jī)械損傷，造成菌體衰亡，菌體數(shù)量減少;轉(zhuǎn)速過(guò)慢，溶氧量不足，培養(yǎng)基易形成沉淀，不利于菌體的生長(zhǎng)和繁殖[33]。當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到250 r/min時(shí)，OD600值最大（見(jiàn)圖3 d））。因此，枯草芽孢桿菌Asr的最適宜攪拌轉(zhuǎn)速為250 r/min。

3 結(jié)果與討論

枯草芽孢桿菌Asr的菌體產(chǎn)量與培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件有關(guān)。本研究顯示，培養(yǎng)基成分中酵母浸粉對(duì)菌體產(chǎn)量的影響最大，與已有文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致?？赡苁怯捎诮湍附壑泻胸S富的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠被菌株快速吸收，從而促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)繁殖。在發(fā)酵工業(yè)中，接種量的大小直接影響活菌數(shù)量的增長(zhǎng)，較大的接種量可以使菌株快速生長(zhǎng)繁殖，增大菌株活力，但過(guò)大的接種量會(huì)使菌株過(guò)早老化，影響菌體產(chǎn)量[34-35]。本研究得出枯草芽孢桿菌Asr的最佳接種量為10%。

本研究采用的初始發(fā)酵培養(yǎng)基與大多數(shù)研究學(xué)者采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵所用培養(yǎng)基成分一致[26-27]，但對(duì)枯草芽孢桿菌Asr的發(fā)酵能力偏低，因此前期試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基成分中的無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行了調(diào)整，作為本研究的原始發(fā)酵培養(yǎng)基。采用正交試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)既定培養(yǎng)基的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，提高了枯草芽孢桿菌Asr的菌體產(chǎn)量;得出最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉8.65 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L;最佳培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、初始pH值7.0、接種量10%、攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min。應(yīng)用優(yōu)化配方及工藝，枯草芽孢桿菌Asr菌株最高產(chǎn)量可達(dá)到7.30×108 cfu/mL，菌體產(chǎn)量較優(yōu)化前提高了3.95倍。研究結(jié)果可為后續(xù)發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)、提高菌體產(chǎn)量提供技術(shù)支撐，也可為其他枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究提供借鑒。

本研究?jī)H在搖瓶和3 L發(fā)酵罐條件下對(duì)枯草芽孢桿菌Asr菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行了初步探索，對(duì)該菌的產(chǎn)芽孢量及發(fā)酵過(guò)程中抗菌蛋白的增加量尚有待作進(jìn)一步的研究。后期還需在工廠10 t發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn)，逐步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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