王成芳，邵 帥，曲功霖，齊雪松，茍 巧

(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點實驗室，北京 100088)

腹盆腔惡性腫瘤的種類很多，主要有消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌、胃癌和直腸癌；婦科腫瘤如宮頸癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌等。發(fā)病率逐年升高，胃癌、結(jié)直腸癌和肝癌更是除肺癌以外的我國發(fā)病率和死亡率較高的常見腫瘤。為防止病灶轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，通常要進行放射治療。放射性腸損傷，是腹盆腔惡性腫瘤放射治療引起的常見并發(fā)癥，小腸上皮細胞對放射線高度敏感，射線能夠使小腸絨毛縮短，上皮細胞脫落，炎癥細胞浸潤，最終導(dǎo)致腸黏膜功能被破壞，從而出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、細菌感染等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前，針對放射性腸道損傷仍舊缺少防治藥物。中草藥及其天然成分不僅具有藥源廣泛、毒性小等特點，而且可以通過多種途徑、多靶點治療疾病，其中許多具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和清除自由基等作用[2-4]。中藥注重整體調(diào)理，且有與化學(xué)合成藥物相互補充的作用，可用于癌癥的放療過程中的輻射防護。

本課題組已有研究顯示，四君子湯對淋巴母細胞AHH-1及BALB/c小鼠的電離輻射損傷具有較好的防護作用[5-7]。為進一步探討其在腸道輻射損傷中的作用，本文以人小腸上皮細胞HIEC-6為受試對象，研究四君子湯水提物對其輻射損傷的影響，旨在為臨床應(yīng)用四君子湯治療急性放射病及腫瘤放療過程中腸道損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與主要試劑

Thermo CO2恒溫培養(yǎng)箱、Multiskan GO型連續(xù)波長酶標儀，購自美國Thermo公司；FACS Calibur流式細胞儀，購自美國BD公司；Axiocam ERC5S型倒置顯微鏡，購自德國ZEISS公司；5810R型離心機，購自德國Eppendorf 公司；TP-214型分析天平，購自丹佛儀器(北京)有限公司；Milli-Q A10型純水儀，購自美國Millipore公司；電泳儀、化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad 公司；Image J 公共圖像處理軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)。四君子湯水提取物(黃色粉末)為本所毒理室提取噴霧干燥所得，用時用細胞培養(yǎng)液(含5%胎牛血清的Opti-MEM)溶解配制。胎牛血清和細胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Annexin V-PE/7AAD細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；細胞周期檢測試劑盒(美國Thermo 公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋公司)；兔抗人γH2AX(美國Cell Signaling Technology 公司)；小鼠抗人Bcl-2、β-tublin 抗體(美國Abcam 公司)；總蛋白提取、蛋白定量及ECL 發(fā)光檢測試劑盒(北京普利萊公司)；標準蛋白Marker(美國Thermo 公司)。

1.2 藥物配制

稱取四君子湯水提物粉末(四君子湯粉末提取率為35.5%)，加培養(yǎng)液溶解，配制成1.90 mg/mL藥液，實驗中倍比稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 照射條件

北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院鈷源60Co γ射線照射，源強5 000 Ci，照射距離為79 cm，劑量率為1.0 Gy/min。

1.4 細胞培養(yǎng)

人小腸上皮細胞HIEC-6購自上海紀寧實業(yè)有限公司。用含4%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每3天換1次培養(yǎng)基，每周傳代1次。

1.5 CCK-8檢測細胞存活率

取對數(shù)生長期的HIEC-6細胞接種于96孔板，5×103個/孔，每組設(shè)6個復(fù)孔，接種后24小時經(jīng)不同劑量(0、2、4、6、8、10 Gy)的60Co γ射線照射或照射前1小時用含不同濃度(1.90、0.95、0.48、0.24、0.12、0.06 mg/mL)四君子湯水提物的培養(yǎng)基作用細胞，給予4.0 Gy γ射線照射(設(shè)立對照組和空白對照組)。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h，按照CCK-8試劑盒說明書操作。全波長酶標儀測定各孔450 nm波長下吸光度(OD)，計算細胞存活率。細胞存活率=(OD處理組-OD培養(yǎng)液對照組)/(OD空白對照組-OD培養(yǎng)液對照組)×100%。

1.6 細胞凋亡與周期檢測

取對數(shù)生長期的HIEC-6細胞接種于6 孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，照射前1 h分別經(jīng)0.95、0.24和0.06 mg/mL藥物作用，設(shè)立空白對照組和照射對照組，給予4.0 Gy的照射劑量后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，按照細胞凋亡和細胞周期試劑盒說明書操作。經(jīng)流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率和死亡率；細胞周期檢測結(jié)果經(jīng)ModFit LT(Verity Software House, Topsham, ME, USA)軟件分析。

1.7 γH2AX、Bcl-2蛋白的表達

細胞接種和實驗分組同細胞周期檢測，照射3 d后收獲細胞。提取細胞總蛋白30 μg 進行聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜。一抗采用兔抗人γH2AX和小鼠抗人Bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜；二抗采用HRP 標記山羊抗兔抗體(1∶3 000 稀釋)常溫孵育1 h。用小鼠抗人β-tublin 抗體(1∶2 000稀釋)再進行雜交作為內(nèi)參照。經(jīng)化學(xué)發(fā)光液孵育，Bio-Rad ChemiDoc XRS+ 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影拍照(Bcl-2 蛋白分子量為26 kDa，γH2AX 蛋白分子量為17 kDa，β-tublin蛋白分子量為55 kDa)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有計量資料均采用均值±標準差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗：方差齊，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用q檢驗；方差不齊，采用秩和檢驗。p<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIEC-6細胞對γ射線的敏感性

CCK-8 試劑盒檢測不同劑量(0、2、4、6、8、10 Gy)γ射線照射后HIEC-6細胞在24～96 h的存活率，結(jié)果示于圖1。由圖1可見，照射后的24～72 h，細胞的存活率與照射劑量、受照時間的依賴關(guān)系并不明顯，即細胞的存活率不是逐漸降低的，這可能與輻射誘導(dǎo)細胞周期調(diào)控、凋亡以及修復(fù)程度不同有關(guān)。而在照射后96 h，隨著照射劑量的增加，細胞的存活率則顯著降低。因此，在后面藥物輻射損傷保護作用實驗中，選擇4.0 Gy的照射劑量。

圖1 人小腸上皮細胞HIEC-6不同劑量照射后24～96 h的細胞存活率

2.2 四君子湯對60Co γ射線照射后HIEC-6細胞增殖的影響

圖2為四君子湯對不同劑量60Co γ射線照射后人小腸上皮細胞HIEC-6增殖的影響。由圖2可見，4.0 Gy γ射線照射后96 h的人小腸上皮細胞HIEC-6存活率為55%，而照射前經(jīng)四君子湯水提物處理后，細胞存活率明顯升高(p<0.01)，說明藥物對細胞具有顯著的保護作用，且與藥物濃度呈正相關(guān)，即隨著濃度升高，細胞存活率顯著增加，在0.95 mg/mL時，細胞的存活率達到84%，較之照射對照組增加了29%，而升高藥物濃度2倍后(1.90 mg/mL)，細胞存活率并無明顯變化。因此，后續(xù)實驗的藥物濃度最高使用0.95 mg/mL。

*與空白對照組比較差異非常顯著，p<0.01；△與照射對照組比較差異顯著，p<0.05；△△與照射對照組比較差異非常顯著，p<0.01。

2.3 四君子湯對60Co γ射線照射后HIEC-6細胞凋亡的影響

表1和圖3為四君子湯對4.0 Gy60Co γ射線照射后人小腸上皮細胞HIEC-6凋亡的影響。由表1和圖3可見，人小腸上皮細胞HIEC-6經(jīng)4.0 Gy照射后72 h，細胞凋亡率12.14%，死亡率2.21%，顯著高于空白對照組(p<0.05)。照射前1 h給予不同濃度四君子湯水提物(0.95、0.24、0.06 mg/mL)處理后，細胞凋亡率和死亡率顯著降低(p<0.01)。表明藥物干預(yù)使細胞凋亡減少并具有保護作用。

圖3 流式細胞術(shù)檢測不同處理組的HIEC-6細胞凋亡圖

表1 四君子湯對照射后HIEC-6細胞的凋亡率和死亡率的影響(n=3)

2.4 四君子湯對60Co γ射線照射后HIEC-6細胞周期的影響

表2為四君子湯對4.0 Gy60Co γ射線照射后人小腸上皮細胞HIEC-6細胞周期的影響。由表2可見，HIEC-6細胞照射后72 h，細胞周期在S、G2/M期均有阻滯，與空白對照組相比，G1期的細胞比例顯著降低，S、G2/M期比例升高。照射前給予四君子湯水提物0.95 mg/mL處理后，與照射組相比，S期細胞比例顯著降低(p<0.01)，G1期的細胞比例顯著增加(p<0.05)，表明藥物干預(yù)后，細胞周期S期阻滯得到緩解。

表2 四君子湯對照射后HIEC-6 細胞周期分布比例的影響(%)(n=3)

2.5 四君子湯對HIEC-6細胞照射后Bcl-2和γH2AX蛋白表達的影響

圖4為四君子湯對4.0 Gy60Co γ射線照射后人小腸上皮細胞Bcl-2和γH2AX蛋白表達的影響。圖4的蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，同空白對照組(C)相比，照射對照組(IR)Bcl-2蛋白表達明顯降低，而γH2AX蛋白表達明顯升高，經(jīng)0.95 mg/mL的四君子湯水提物處理后(0.95+IR)，減緩了這一變化，Bcl-2蛋白表達升高，γH2AX蛋白表達降低，提示四君子湯水提物可能通過調(diào)控Bcl-2和γH2AX的表達來減緩人小腸上皮細胞HIEC-6的輻射損傷。

圖4 HIEC-6細胞的Bcl-2和γH2AX蛋白表達情況

3 討論

輻射引起的細胞損傷常常表現(xiàn)為細胞增殖受到抑制，細胞周期進程產(chǎn)生變化，細胞發(fā)生凋亡和壞死等等。腸黏膜上皮是機體更新活躍的組織之一，對射線高度敏感[8]。本文首先通過CCK-8法檢測不同照射劑量下的人小腸上皮細胞HIEC-6在24～96 h的增殖情況，結(jié)果表明，細胞在照射后96 h增殖受到顯著抑制，而經(jīng)過藥物預(yù)處理后照射(4.0 Gy)，細胞增殖抑制情況得到緩解，凋亡和壞死大大降低，且細胞的存活率隨著藥物濃度的升高而增加，促進HIEC-6的增殖。

腸細胞凋亡是腸黏膜屏障受損的主要原因[9-10]。本研究通過Annexin V-PE/7AAD雙染標記法檢測對于受照后HIEC-6細胞凋亡及壞死，結(jié)果顯示，在4.0 Gy的照射條件下細胞表現(xiàn)為明顯的凋亡和壞死比例升高。通過預(yù)先給藥，四君子湯水提物顯示出對HIEC-6細胞的保護作用，較為明顯地降低了細胞損傷程度，并且這種作用可能持續(xù)至照后72 h。此外，射線可使凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表達降低或Bcl-2蛋白穩(wěn)定性下降，使凋亡的發(fā)生率明顯增加。細胞在受到電離輻射后，DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷(double strands breaks，DSBs)，組蛋白H2AX快速發(fā)生磷酸化(即γH2AX)，一旦γH2AX介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)完成后，γH2AX會被Pph3等脫磷酸化，形成H2AX在其他DNA損傷修復(fù)中被重新利用，從而使γH2AX在損傷位點被有效的去除。本文檢測了照射后72 h細胞的γH2AX蛋白表達，發(fā)現(xiàn)其仍有表達，而經(jīng)過四君子湯作用后的細胞γH2AX表達有所下降，其可能通過某種細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使輻照后HIEC-6細胞Bcl-2基因的蛋白表達量增加，增強細胞DNA損傷修復(fù)能力，激活存在的DNA修復(fù)酶，促進DNA復(fù)制，抑制細胞發(fā)生凋亡，從而起到保護小腸上皮細胞的作用。細胞周期檢測結(jié)果顯示，照射后的細胞S、G2/M期比例升高，表明輻射誘導(dǎo)的DNA損傷阻礙了基因組的復(fù)制進程[11]，四君子湯則降低了細胞S期、提高了G1期的比例，促進細胞的修復(fù)，起到保護作用。

四君子湯作為我國傳統(tǒng)的中藥補益劑，臨床常用于治療慢性胃炎、消化性潰瘍等屬脾胃氣虛者。中醫(yī)認為脾胃為后天之本，與機體免疫能力息息相關(guān)，因而四君子湯在臨床上也用于腫瘤患者放化療后的輔助用藥，目的是提高患者的免疫能力抵抗放化療的毒副作用[12-13]。本文的研究結(jié)果表明，四君子湯在人小腸上皮細胞輻射損傷中具有修復(fù)作用，其作用機制與調(diào)控細胞周期進程、減少細胞凋亡、促進DNA損傷修復(fù)相關(guān)，為腹盆腔腫瘤放療過程中腸道損傷的防治提供了實驗依據(jù)。