張海林 劉占燕 張夢宇 譚可心 張禮叢 張玉然

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，日照 276826)

細(xì)菌素是一類由細(xì)菌核糖體編碼合成，對(duì)同種親緣的微生物具有高效抑制的一類多肽或前體多肽[1]，綠色環(huán)保、安全高效，被視為抗生素的理想替代品。乳酸鏈球菌素(Nisin)是唯一通過FDA/WHO雙認(rèn)證，商業(yè)化應(yīng)用于食品領(lǐng)域的細(xì)菌素。Nisin在堿性條件下不穩(wěn)定，以及僅能抑制革蘭氏陽性菌，對(duì)革蘭氏陰性菌和真菌等抑制作用效果較差[2]等因素，限制了其應(yīng)用范圍。芽孢桿菌可以代謝產(chǎn)生多種細(xì)菌素，與Nisin相比，大部分芽孢桿菌細(xì)菌素具有耐高溫、耐酸堿、廣譜抑菌的特性[3-4]，具有較高的應(yīng)用前景。

本文擬從高溫酒曲中篩選產(chǎn)細(xì)菌素的芽孢桿菌，研究其生物學(xué)特性，擬開發(fā)一種在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值的細(xì)菌素。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1樣品來源 高溫酒曲，由山東梁山縣儒匠酒曲有限公司提供。

1.1.2菌株 指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC 26112)。實(shí)驗(yàn)菌：大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)，銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)，白色念珠菌(Candida albicans ATCC14053)，痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae CMCC 51252)，黑曲霉ATCC16404。以上菌株均由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3主要儀器與試劑 全溫疊加式搖床(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)；PCR儀(BIO-RAD公司)；電泳儀(北京六一公司)；全自動(dòng)免染凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司)。

LB培養(yǎng)基(上海生工生物工程有限公司)；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；TaqDNA聚合酶(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶K(北京索萊寶科技有限公司)；胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)；PageRuler 預(yù)染蛋白分子(上海賽默飛世爾科技有限公司)；其它試劑均為日照國藥分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的篩選 將10ml無菌水中加入1g高溫酒曲，于70℃保溫30min，取5ml懸浮液于LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h。稀釋適當(dāng)倍數(shù)涂布于LB平板，于37℃培養(yǎng)24h。挑選單菌落菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h。8×103rpm離心去菌體，發(fā)酵上清液中緩慢加入固體硫酸銨，至其終濃度為60%，并置于4℃冰箱中隔夜處理，再經(jīng)1×104rpm離心10min，獲得鹽析沉淀，并將其溶于原體積1/50的0.02mol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液中，制成細(xì)菌素溶液，進(jìn)行抑菌活性測定。

1.2.2產(chǎn)細(xì)菌素芽孢桿菌的種屬鑒定 參考文獻(xiàn)方法[5-6]，以細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取的菌株基因組DNA為模板，采用16S區(qū)通用引物27F/1492R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：菌基因組DNA提取物0.5μl，10×PCR緩沖液2.5μl，dNTP Mixture 2μl，引物27F/1492R對(duì)各1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，補(bǔ)無菌水至25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3min；94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，循環(huán)擴(kuò)增34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測得的16S rDNA基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)，鑒定菌株種屬。

1.2.3細(xì)菌素的分離純化 將發(fā)酵液加熱至100℃，保溫5min，1×104rpm離心10min，留上清，調(diào)節(jié)pH為2.0使蛋白絮凝沉淀，1×104rpm離心10min。將獲得的蛋白沉淀溶于原體積1/50的0.02mol/L pH 7.0磷酸鈉鹽緩沖液中，而后加入固體硫酸銨，至其終濃度為8%，4℃冰箱靜置2h，1×104rpm離心10min，將獲得的蛋白沉淀溶于等體積0.02mol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液中。重復(fù)上述鹽析步驟2次，將得到的細(xì)菌素溶液按1.3.2中Tricine-SDS-PAGE方法進(jìn)行電泳。

1.2.4細(xì)菌素對(duì)pH、溫度、蛋白酶耐受性的測定 將純化的細(xì)菌素溶液pH分別調(diào)節(jié)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0，然后置于37℃處理4h，再將pH調(diào)至7.0，按1.3.1方法測定抑菌活性。

將純化的細(xì)菌素溶液，分別置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下處理30min，以及100℃、110℃、120℃分別處理10min、20min、30min，按1.3.1方法測定抑菌活性。

向0.2ml純化的細(xì)菌素溶液中(預(yù)先調(diào)整至各個(gè)酶的最適合pH，胃蛋白酶樣品pH 2.5)，分別加入0.05ml濃度為5mg/ml的蛋白酶溶液(胃蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶)，然后置于37℃處理6h，再將pH調(diào)至7.0，按1.3.1方法測定抑菌活性。以未加蛋白酶處理的樣品為對(duì)照。

1.3 檢測方法

1.3.1細(xì)菌素抗菌活性的測定 采用雙層瓊脂牛津杯法[7]，指示菌(金黃色葡萄球菌)菌濃為1×106CFU/mL。通過測定抑菌圈直徑大小(mm)，表觀細(xì)菌素抑菌活性。

1.3.2凝膠原位電泳活性檢測 參考Schagger的Tricine-SDS-PAGE方法[8]，在凝膠兩側(cè)平行上樣，電泳結(jié)束后，將凝膠一分為二。一半用于染色，另一半置于1% Triton X-100溶液中，振蕩20min，并水洗2次，去除凝膠中SDS，再以0.1mol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液浸泡平衡10min，然后轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，加入20ml含指示菌(菌濃為1×106)LB培養(yǎng)基(含0.7%瓊脂，45℃)，待其完全凝固后，于37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈位置。

2 結(jié)果和討論

2.1 菌株的鑒定

從高溫酒曲中分離得到一株芽孢桿菌PL-2，其發(fā)酵液經(jīng)60%硫酸銨鹽析得到的蛋白質(zhì)溶液，經(jīng)雙層瓊脂牛津杯法檢測，可顯著抑制指示菌生長。PL-2菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果見表1。

表1 基于菌株P(guān)L-2 16S rDNA序列的比對(duì)分析

經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，LP-2菌株鑒定為Bacillus velezensis，命名為Bacillus velezensis PL-2。

2.2 細(xì)菌素的純化及活性鑒定

經(jīng)高溫煮沸、pH沉淀、鹽析等步驟，得到純度較高的蛋白質(zhì)溶液，然后利用Tricine-SDS-PAGE電泳以及凝膠原位電泳抑菌活性檢測方法，檢測其純度和抑菌活性。與Tricine-SDS-PAGE電泳條帶相對(duì)應(yīng)的位置處出現(xiàn)指示菌抑菌圈，證明該條帶蛋白具有抑菌能力，可初步確定Bacillus.velezensis PL-2產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素(蛋白類物質(zhì))，分子量約10kDa，而非有機(jī)酸、過氧化氫等。B.velezensis PL-2發(fā)酵液只需經(jīng)過簡單的純化步驟，即可獲得純度較高的細(xì)菌素，有利于后續(xù)規(guī)?；崛　Ｒ妶D1。

2.3 細(xì)菌素的pH穩(wěn)定性

分別調(diào)整細(xì)菌素溶液pH并于37℃條件下維持4h，采用雙層瓊脂牛津杯法，分析其抑菌活性的變化。在pH 3.0～14.0范圍內(nèi)，抑菌活性變化均很小，最大降幅為5%。當(dāng)pH為2.0時(shí)，細(xì)菌素發(fā)生絮凝沉淀，但沉淀復(fù)溶后仍能完全保留其抑菌活性。B.velezensis PL-2生產(chǎn)的細(xì)菌素具有寬泛的pH耐受性。見圖2。

注：泳道，1,3-marker，2,4,5-純化的細(xì)菌素圖1 細(xì)菌素的Tricine-SDS-PAGE電泳圖和凝膠原位電泳抑菌活性檢測圖

圖2 細(xì)菌素的pH穩(wěn)定性

2.4 細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

pH 7.0條件下，分別以不同溫度對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行處理，分析其抑菌活性的變化。分別以30℃～100℃溫度處理細(xì)菌素溶液，其抑菌活性基本維持不變；110℃、120℃處理30min，均未見蛋白絮凝析出，其抑菌活性僅分別降低10%和18%。B.velezensis PL-2生產(chǎn)的細(xì)菌素具有很強(qiáng)的溫度耐受性，為其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。見圖3。

圖3 細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

2.5 細(xì)菌素的蛋白酶穩(wěn)定性

分別以不同的蛋白酶處理細(xì)菌素，以未加蛋白酶的細(xì)菌素樣品為空白對(duì)照，分析蛋白酶對(duì)其抑菌活性的影響。目前報(bào)道的細(xì)菌素中，大部分因不能抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶的降解而喪失抑菌活性，而B.velezensis PL-2產(chǎn)的細(xì)菌素均能抵御蛋白酶K、胃蛋白酶等5種蛋白酶的水解，保持較高的抑菌活性。因其具有較強(qiáng)的蛋白酶穩(wěn)定性，可初步判斷為一種抗酶解細(xì)菌素。見圖4。

圖4 細(xì)菌素的蛋白酶穩(wěn)定性

2.6 細(xì)菌素的抑菌菌譜

采用雙層瓊脂牛津杯法，分析B.velezensis PL-2生產(chǎn)的細(xì)菌素對(duì)不同菌屬菌株的抑制活性。B.velezensis PL-2生產(chǎn)的細(xì)菌素具有廣譜抑菌特性，即可抑制革蘭氏陰性菌，也可抑制革蘭氏陽性菌，對(duì)真菌(白色念珠菌、黑曲霉)也具有較強(qiáng)抑制活性，但對(duì)大腸桿菌沒有抑制作用，有待進(jìn)一步研究。見表2。

表2 細(xì)菌素抑菌菌譜

3 結(jié)論

B.velezensis是芽孢桿菌屬一個(gè)新種，直至2005年才被報(bào)道和正式命名，但其在抑制病原菌和生物防治方面具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。本文中B.velezensis PL-2菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素分子量約為10kDa，具有貝萊斯芽孢桿菌細(xì)菌素共有特性(廣譜抗菌特性)。相對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的B.velezensis 菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素[9-10]，該細(xì)菌素具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定，可耐受100℃高溫，即使在120℃高溫下處理30min，其抑菌活性也僅降低18%。此外，該細(xì)菌素既可耐受強(qiáng)酸環(huán)境，也可耐受強(qiáng)堿的環(huán)境，寬泛的pH耐受性也優(yōu)于目前文獻(xiàn)報(bào)道的貝萊斯芽孢桿菌細(xì)菌素。后續(xù)可對(duì)該細(xì)菌素的生理毒性進(jìn)行研究，開發(fā)其在食品加工、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

志謝:在研究過程中，山東梁山縣儒匠酒曲有限公司提供高溫酒曲，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供實(shí)驗(yàn)場所及相關(guān)設(shè)備，保障了本研究的順利進(jìn)行，特此表示感謝。