鄒 紅,李劍鴻,陳 果,王曉燕，陳曉帆,李 廠

湖南省湘潭市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南湘潭 411101

結(jié)核病是全球十大死因之一，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，2017年全球約有1 010萬結(jié)核病發(fā)病病例，而我國作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核病防治工作形勢(shì)十分嚴(yán)峻[1-2]，早發(fā)現(xiàn)、早診斷是減少結(jié)核病傳播，控制疫情的關(guān)鍵[3-4]。痰涂片抗酸染色顯微鏡檢查是“十三五”全國結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施中的一個(gè)重要組成部分，也是診斷結(jié)核病最基本的病原學(xué)檢查方法。由于痰涂片抗酸染色直接鏡檢陽性率較低[5-6]，不同種類的集菌法能提高痰抗酸桿菌陽性率[7-9]，且各有優(yōu)劣勢(shì)，本研究以新型抗酸桿菌集菌法檢測(cè)痰標(biāo)本中的抗酸桿菌，以液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法為對(duì)比，發(fā)現(xiàn)新型抗酸桿菌集菌法可以提高抗酸桿菌的陽性檢出率，且通過對(duì)原始標(biāo)本的滅活處理可提高生物安全操作性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源 416例肺結(jié)核患者來自2019年1月1日至2020年5月15日在湘潭市岳塘區(qū)管理的傳染病信息報(bào)告系統(tǒng)結(jié)核病管理系統(tǒng)中登記在案的病例，診斷依據(jù)符合中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：WS288-2017[10]。按照肺結(jié)核患者的管理要求留取痰標(biāo)本。初診失敗指初診肺結(jié)核患者治療第5個(gè)月末或療程結(jié)束時(shí), 痰涂片或培養(yǎng)檢查陽性,或涂陰患者治療過程中出現(xiàn)痰檢陽性。復(fù)治失敗指復(fù)治涂陽肺結(jié)核患者治療第5個(gè)月末或療程結(jié)束時(shí),痰涂片或培養(yǎng)檢查陽性。其他屬于8個(gè)月末之后的時(shí)間段。

1.1.2儀器與試劑 液基夾層杯法抗酸染色液、彭氏夾層杯、消化滅活液、取片針、TQ-12自動(dòng)離心機(jī)均由湖南天騎公司提供；改進(jìn)型抗酸染色消化集菌液，2%的NaOH(購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)和3%的N-乙酰L-半胱氨酸(購自上海阿拉丁有限公司)混合液由本實(shí)驗(yàn)室自配；直接涂片抗酸染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法 液基夾層杯法嚴(yán)格按照液基夾層杯抗酸染色試劑盒說明書步驟操作。新型抗酸桿菌集菌法操作步驟如下：于干凈玻璃試管中按標(biāo)本和改進(jìn)型抗酸染色消化集菌的比例1∶(2～4)倍的量加入后震蕩15 s，置78 ℃的水浴箱中20 min后，4 500 r/min離心5 min，棄上清液取沉渣涂片，干片后火焰來回3次固定，再用抗酸染色脫色液沖洗一遍，然后嚴(yán)格按照萋尼氏染色顯微鏡鏡檢。為保證結(jié)果的可比性，同一份痰標(biāo)本使用液基夾層杯法和新型抗酸桿菌集菌法操作時(shí)保證均為1 mL左右的量。直接涂片法參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃:痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[11]操作。

1.2.2質(zhì)量控制 痰標(biāo)本抗酸染色鏡檢質(zhì)量控制參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃:痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[11]執(zhí)行。

1.2.3新型抗酸桿菌集菌法安全性試驗(yàn) 10份直接涂片抗酸陽性(++++)的標(biāo)本，5份BD960液體培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性的標(biāo)本，設(shè)定不同配比的消化集菌液及水浴時(shí)間后，再接種至BD960液體培養(yǎng)基觀察分枝桿菌生長(zhǎng)情況，評(píng)價(jià)新型抗酸桿菌集菌法滅活集菌的安全性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種方法陽性檢出率 416例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本同時(shí)采用3種方法處理，同一患者同一份痰標(biāo)本任意一種方法陽性判斷為病原學(xué)陽性患者。新型抗酸桿菌集菌法、液基夾層杯法、直接涂片抗酸染色法抗酸桿菌的陽性檢出率分別為44.7%(186/416)、40.1%(167/416)、26.2%(109/416)。

2.2新型抗酸桿菌集菌法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較 新型抗酸桿菌集菌法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=69.59，P<0.05)。見表1。

表1 新型抗酸桿菌集菌法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出情況比較(n)

2.3液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較 液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.40，P<0.05)。見表2。

表2 液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法陽性檢出情況比較(n)

2.4新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法陽性檢出率比較 新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.17，P<0.05)。見表3。

2.5初治或復(fù)治失敗患者新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法檢出比較 以新型抗酸桿菌集菌法檢出陽性為對(duì)照，對(duì)10例初治或復(fù)治失敗患者不同時(shí)間段的痰標(biāo)本進(jìn)行隨訪跟蹤，發(fā)現(xiàn)在10例患者中，隨著治療時(shí)間的推移，在觀察時(shí)間段內(nèi)，新型抗酸桿菌集菌法均可以檢出，而液基夾層杯法漏檢8例。見表4。

表3 新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法陽性檢出情況比較(n)

表4 10例初治或復(fù)治失敗患者新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法檢出比較

2.6新型抗酸桿菌集菌法安全性試驗(yàn) 10份直接涂片抗酸陽性(++++)的標(biāo)本，5份BD960液體培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性的標(biāo)本經(jīng)2%NaOH和3%N-乙酰L-半胱氨酸混合液消化，再78 ℃水浴15～20 min后，接種BD960液體培養(yǎng)42 d后未報(bào)陽，未見抗酸桿菌生長(zhǎng)。而78 ℃水浴時(shí)間不足或NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比不當(dāng)?shù)奶幚矸绞骄锌顾釛U菌生長(zhǎng)。見表5。

表5 不同NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比及水浴時(shí)間的安全性試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

抗酸染色至今仍是結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷的主要方法之一，然而痰直接涂片抗酸染色鏡檢靈敏度低，通常痰液中分枝桿菌的濃度達(dá)到每毫升5 000～10 000條時(shí)才能得到陽性結(jié)果，如何提高痰涂片抗酸桿菌鏡檢的靈敏度對(duì)結(jié)核患者的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)工作具有重大意義。本研究課題組前期通過試驗(yàn)驗(yàn)證不同濃度的NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸消化液，在78 ℃左右(不超過80 ℃)水浴不同時(shí)間，新型抗酸桿菌集菌法安全有效的操作標(biāo)準(zhǔn)后，開始對(duì)臨床標(biāo)本做新型抗酸桿菌集菌法臨床應(yīng)用效果的研究。78 ℃水浴溫度的選擇考慮了結(jié)核分枝桿菌對(duì)濕熱的靈敏度，然而痰標(biāo)本如果不液化處理就達(dá)不到濕熱對(duì)抗酸桿菌的殺滅效果；痰標(biāo)本的液化處理采用的N-乙酰L-半胱氨酸在高于80 ℃時(shí)易失活，單純的N-乙酰L-半胱氨酸對(duì)痰液化效果不理想，且結(jié)核分枝桿菌對(duì)一定濃度的NaOH有抵抗力，本研究通過試驗(yàn)確定了理想的NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比及水浴溫度和時(shí)間。結(jié)核分枝桿菌的抵抗力在中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷:WS288-2017附錄A肺結(jié)核病原學(xué)中有提及[10]。

本研究結(jié)果顯示，新型抗酸桿菌集菌法抗酸桿菌陽性檢出率要優(yōu)于液基夾層杯法和直接涂片抗酸染色法。液基夾層杯法、新型抗酸桿菌集菌法與直接涂片抗酸染色法兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其原因分析如下：分枝桿菌抗酸性的強(qiáng)弱除與細(xì)胞壁的完整性有關(guān)以外，還與其細(xì)胞成熟和衰老程度有關(guān)。抗酸染色的原理是分枝桿菌含有分枝菌酸，可與苯酚復(fù)紅牢固結(jié)合，不易被酸性乙醇脫色。分枝桿菌抗酸性是菌體內(nèi)分枝菌酸、RNA蛋白及細(xì)胞壁的完整性相結(jié)合的綜合反應(yīng)。液基夾層杯法因采用集菌法能提高痰抗酸桿菌陽性率[12-15]。然而液基夾層杯法使用的消化液在對(duì)分枝桿菌的菌體滅活的同時(shí)也影響抗酸桿菌的著色性及集菌效果，且由于液基夾層杯法操作時(shí)對(duì)背景細(xì)胞的破壞嚴(yán)重，觀察視野背景為白色，比較刺眼，不利于觀察者的觀察，容易造成漏檢，使得液基夾層杯法檢出陽性率(40.1%)稍低于新型抗酸桿菌集菌法(44.7%)。 筆者發(fā)現(xiàn)部分初治或復(fù)治失敗患者的痰標(biāo)本在直接涂片抗酸染色陽性的情況下，液基夾層杯法是陰性，而新型抗酸桿菌集菌法因采用對(duì)抗酸桿菌菌體損傷較小的化學(xué)法和對(duì)抗酸桿菌抗酸性沒有影響的物理方法，達(dá)到集菌的目的，從而除適用于初診和疑似患者的痰標(biāo)本之外，也適合于初治失敗或復(fù)治患者的隨訪跟蹤。本研究跟蹤10例初治或復(fù)治失敗患者不同時(shí)間段的痰標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在10例患者中，隨著治療時(shí)間的推移，在觀察的時(shí)間段內(nèi)與新型抗酸桿菌集菌法相比，液基夾層杯法漏檢8例。劉燕文等[12]研究也顯示，某些長(zhǎng)期服用抗結(jié)核藥物的患者其結(jié)核分枝桿菌抗酸性減弱，加上消化液對(duì)菌體的影響使得用液基夾層杯法檢測(cè)變成陰性。

從陽性片閱片的時(shí)間成本上比較，同一患者同一份痰標(biāo)本因集菌法提高了每視野中抗酸桿菌的菌量，需要觀察的視野數(shù)可以減少，閱片視野數(shù)在中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-肺結(jié)核診斷:WS288-2017附錄B分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢查中有提及[10]，能明顯減輕觀察者的負(fù)擔(dān)。陰性片的閱片時(shí)間沒有差異。

直接涂片抗酸染色法相較于新型抗酸桿菌集菌法和液基夾層杯法雖然陽性檢出率要低，但是也存在對(duì)于同一份標(biāo)本直接涂片抗酸染色陽性而其他2種方法陰性的情況，這與抗酸桿菌菌量很少，且抗酸桿菌在標(biāo)本中分布有一定的聚集性有關(guān)。雖然集菌法也存在漏檢，但標(biāo)本量使用多的集菌法漏檢的概率會(huì)小得多。

本研究的不足之處：因抗酸桿菌的涂片鏡檢存在死菌依然陽性的情況，10例初治或復(fù)治失敗抗酸桿菌涂片陽性患者未用同一份標(biāo)本做結(jié)核培養(yǎng)甚至有未做培養(yǎng)的情況。

綜上所述，新型抗酸桿菌集菌法具有快速、簡(jiǎn)單、生物安全性高、檢出率高的優(yōu)勢(shì)，優(yōu)于直接涂片抗酸染色法及液基夾層杯法。