白海，劉麗敏，安志鵬，張永芳，袁文燕，馬毅

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2. 山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；3. 天津通和飼料有限公司博士后科研工作站，天津 301700；4. 天津畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112；5. 山西大同大學(xué)神經(jīng)炎癥及變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山西大同 037009)

近年來隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用存在著濫用和亂用等問題[1]，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實(shí)施《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃(2017-2020年)》，在2019年7月9日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告正式發(fā)布，標(biāo)志著所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑將逐步退出，飼料中“減抗/替抗”已成定局。而“益生菌”(Probiotics)被認(rèn)為是飼料“減抗/替抗”的主力軍之一。

“益生菌”最早是由Liny和Stillwell在1965年提出的，被定義為“對(duì)飼養(yǎng)動(dòng)物腸道菌群平衡有益的促進(jìn)物或微生物”[2]，是一種“活的微生物，適當(dāng)補(bǔ)充時(shí)有利于宿主身體健康”[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2013年公布了飼料中允許添加的34種微生物種類，主要是：乳酸菌、芽孢桿菌和真菌。芽孢桿菌因其可以耐酸耐高溫，因此經(jīng)常添加到飼料中，其主要功能是：提高飼料消化率，改善腸道健康，調(diào)節(jié)免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)生產(chǎn)性能[4]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，是芽孢桿菌屬中最常見的一種，屬于好氧細(xì)菌，在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等活性物質(zhì)[5]，可明顯抑制致病菌生長(zhǎng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃腸道的菌群平衡。本研究通過對(duì)羊源枯草芽孢桿菌進(jìn)行分離鑒定和活性分析，為微生態(tài)制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和動(dòng)物 LB固體和液體培養(yǎng)基；革蘭氏染色按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制；8～10 周齡雄性BALB/c小鼠24只，體重20～25 g，購(gòu)于北京維通利華公司，飼養(yǎng)于山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院腦研究所動(dòng)物房。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)SW-CF(上海博速實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；立式壓力蒸汽滅菌器LS-35LJ(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)；電子天平JH1102(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱SPX-100B-Z(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；恒溫?fù)u床GW-D(北京市六一儀器廠)，顯微鏡UB102i(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)，血球計(jì)數(shù)板QIUJING(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；5 mL和1 mL 無菌注射器(江西紅新醫(yī)療器械有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)HC-2062(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；微波爐G70F20 N2L-DG(廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司)；移液槍(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器)；小鼠灌胃針(8號(hào))。

1.3 菌株的分離及染色 健康綿羊的新鮮糞便取自山西省大同市陽高縣羅文皂鎮(zhèn)十九墩村。稱取1 g新鮮羊糞，用研缽迅速研碎，裝在盛有99 mL的無菌水的錐形瓶中，振蕩5 min，制成懸浮液，在水浴鍋中100 ℃水浴加熱10 min。取10 mL懸液加入到無菌試管中，之后每次取1 mL菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋，配制成10-2～10-6的濃度梯度溶液。將配制好的梯度溶液在超凈臺(tái)中分別進(jìn)行平板劃線，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～36 h，挑取乳白色、薄膜狀帶有褶皺的疑似菌落，接種到新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基上只生長(zhǎng)出單一菌落。

取一滴純培養(yǎng)的菌液，用適量的生理鹽水稀釋后涂片并經(jīng)革蘭氏染色，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。染色方法參考試劑說明書。

1.4 16S rRNA的測(cè)序和序列比對(duì)分析 16S rRNA序列采用通用的特異性引物來擴(kuò)增：正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物 1492R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：TaKaRaLaTaq0.5 μL，DNA模板 2 μL，10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 8 μL，上、下游引物各 2 μL，雙蒸水 30.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)責(zé)任有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析，通過MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生長(zhǎng)曲線 將菌株接種至已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(37 ℃，180 rpm條件下過夜培養(yǎng))。預(yù)先準(zhǔn)備已滅菌的錐形瓶3個(gè)，并配置新的液體培養(yǎng)基，滅菌后分裝至錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中各100 mL。之后，向各錐形瓶中分別加入100 μL預(yù)先培養(yǎng)的菌液，37 ℃恒溫?fù)u床進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，4 h后吸取少量菌液進(jìn)行OD 600測(cè)定，之后每隔2 h進(jìn)行OD 600測(cè)定，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.6 耐酸試驗(yàn) 參考冼瓊珍等的方法[6]，將芽孢桿菌懸液分別接種到pH值為2.0和3.0的液體LB培養(yǎng)基中，芽孢桿菌的初始濃度為1×106CFU·mL-1，37 ℃條件下120 rpm條件下培養(yǎng)，分別在1.5 h和2.5 h后取1 mL菌液進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)24 h，進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 菌株的安全性評(píng)價(jià) 采用腹腔注射和口腔灌胃兩種方法對(duì)小鼠實(shí)行實(shí)驗(yàn)，24 只小鼠隨機(jī)分成A1、A2、B1、B2四組，每組6只。A1組腹腔注射 0.1 mL 0.9%生理鹽水，A2組腹腔注射 0.1 mL枯草芽孢桿菌菌液(活菌數(shù)量為 5.0×109CFU/mL)，B1組口服灌胃 0.1 mL 0.9 %生理鹽水；B2組口服灌胃0.1 mL枯草芽孢桿菌菌液(活菌數(shù)量為 5.0×109CFU/mL)。每日14:30對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，持續(xù)15 d。第15 d小鼠禁食6 h后稱量體重，并處死小鼠，取出心、肝、脾、肺、腎、睪丸等臟器，并稱量，計(jì)算臟器系數(shù)，肉眼觀察各臟器病理變化。

臟器系數(shù)=實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量/動(dòng)物體重。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從綿羊糞便中分離出疑似菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行純化，純化后的菌落形態(tài)如圖1A所示，菌落呈現(xiàn)乳白色薄膜狀，有褶皺，菌體呈長(zhǎng)桿狀，染色為紅色，為革蘭氏陽性菌(圖1B)。

圖1 A疑似菌株的菌落(100×)；B桿菌革蘭氏染色呈陽性(1000×)

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 將所測(cè)序列在NCBI中經(jīng)Blast初步比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，其與BacillussubtilisZY-05的同源性達(dá)到99.52%，與Bacillussubtilisstrain IAM_12118同源性達(dá)到99.10%。通過MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示菌株Isolated strain與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系最近，聚類為一支，而與Bacillusthuringiensisstrain距離較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 菌株生長(zhǎng)曲線的繪制 這株枯草芽孢桿菌在4 h到8 h之間生長(zhǎng)速度最快，迅速到達(dá)生長(zhǎng)速度的峰值。在此之后枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)速度逐漸減慢，從穩(wěn)定期開始慢慢進(jìn)入衰亡期，且在26 h后其濃度再次上升。

圖3 細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線

2.4 耐酸性試驗(yàn) 由表1可知，枯草芽孢桿菌在pH=2.0 和pH=3.0條件下，處理1.5 h后，其存活率都在80%以上；而在pH為2.0處理2.5 h以后，細(xì)菌的存活率會(huì)下降至43.9%，存活率下降明顯，而在pH為3.0處理2.5 h以后，細(xì)菌的存活率會(huì)下降至60.7%，存活率明顯提高。說明該菌株具有較好的酸性耐受能力。

表1 不同 pH 環(huán)境下枯草芽孢桿菌的存活率

2.5 菌株安全性評(píng)價(jià) 由表2可知，在15 d試驗(yàn)期間，各組小鼠均存活且小鼠體征均未見明顯變化，剖解小鼠，檢測(cè)心、肝、脾、肺、腎、睪丸等臟器，肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)明顯異常，同時(shí)A1與A2、B1與B2的臟器系數(shù)相比較均無明顯差異(P>0.05)。

表2 小鼠臟器系數(shù)

3 討論與結(jié)論

早在1941年，第二次世界大戰(zhàn)非洲軍團(tuán)的德國(guó)士兵常因感染痢疾而喪命，后經(jīng)科學(xué)家從新鮮駱駝糞便中分離出枯草芽孢桿菌，制成抗痢疾藥從而阻止疫情蔓延[7]。此外枯草芽孢桿菌還在畜牧業(yè)中廣泛使用[8]，可提高畜禽的生產(chǎn)性能，是替代抗生素的有效途徑[9]。

本研究從綿羊糞便中分離并經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和革蘭氏染色鏡檢，以及16S rRNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)其與BacillussubtilisZY-05的相似度達(dá)到99.52%，確定該菌株為枯草芽孢桿菌。通過測(cè)定該菌株的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)在適宜生長(zhǎng)條件下，該菌株生長(zhǎng)速度較快，在4 h后就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h達(dá)到峰值。因此，其最適宜的培養(yǎng)時(shí)間為8 h。

枯草芽孢桿菌可在惡劣的外部環(huán)境下形成內(nèi)生的孢子，對(duì)干熱、濕熱、高溫、高壓、紫外線、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等不良條件具有很強(qiáng)的抗逆性。鐘羅華等對(duì)6株豬源芽孢桿菌進(jìn)行分離鑒定和耐酸性研究，發(fā)現(xiàn)其中4株芽孢桿菌可以耐高溫、耐酸，特別是枯草芽孢桿菌耐受能力最強(qiáng)，在pH=2的條件下，存活率可達(dá)60%[10]；艾文豪對(duì)不同菌株的枯草芽孢桿菌進(jìn)行耐酸檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)B5株耐酸效果最好，在pH=1.5的條件下，存活率仍可達(dá)70%以上[11]。本研究是從100 ℃沸水中加熱10 min后篩選得到的枯草芽孢桿菌，篩選出的菌株具有很強(qiáng)的耐高溫能力；在耐酸能力的檢測(cè)中，在pH值為3.0時(shí)，經(jīng)過1.5 h后，其存活率為85.2%，經(jīng)過2.5 h后，其存活率為60.7%，顯示出該菌株良好的抗逆性。

菌株安全性是益生菌關(guān)注的焦點(diǎn)，其中相關(guān)的副作用主要是全身感染、代謝物、佐劑和免疫調(diào)節(jié)以及基因漂流的風(fēng)險(xiǎn)。其中最常見的不良反應(yīng)包括胃腸道疾病，如腹瀉、惡心、腸胃氣脹、消化不良和腹痛；其他副作用包括呼吸道感染、膿腫、過敏反應(yīng)和嚴(yán)重的醫(yī)療狀況，如敗血癥、菌血癥和心內(nèi)膜炎等等[12]。本研究經(jīng)過15 d小鼠飼喂的安全性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)小鼠的飲水、采食、糞便及活動(dòng)均正常，無死亡小鼠出現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組相比，心、肝、脾、肺、腎、睪丸等器官均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變，各組的小鼠的臟器系數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)。因此，該菌株對(duì)小鼠無毒副作用，作為益生菌來使用是安全的，以后可作為潛在的養(yǎng)羊生產(chǎn)中應(yīng)用的益生菌菌株。