曾慶環(huán)，孫亞男，李 鵬，劉遠(yuǎn)志，吳燕京，熊 峰，武永樂(lè)，曾阿娟，張世斌

目前，急性戊型肝炎(acute hepatitis E，AHE)現(xiàn)癥感染診斷指標(biāo)包括:①血清和(或)糞便檢測(cè)到戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)顆粒或HEV RNA；②抗-HEV IgM陽(yáng)性；③血清抗-HEV IgG陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度有4倍及以上升高[1,2]。一般來(lái)說(shuō)，這三項(xiàng)中任何一項(xiàng)陽(yáng)性均可作為診斷AHE的依據(jù)，若同時(shí)有2項(xiàng)陽(yáng)性則可確診。病毒顆?；騌NA是感染的直接證據(jù)，但AHE潛伏期長(zhǎng)，病毒血癥短暫，30%～50%患者在發(fā)病時(shí)體內(nèi)HEV已基本被清除，其臨床診斷意義有限?？?HEV IgG陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度有4倍及以上升高，這一指標(biāo)需定期檢測(cè)雙份血清，不利于早期診斷，多數(shù)患者就診時(shí)IgG抗體常已陽(yáng)轉(zhuǎn)并達(dá)到較高的水平，因此該指標(biāo)用于診斷急性戊型肝炎的實(shí)用性較差。由于在細(xì)胞培養(yǎng)中不能大量收獲HEV以制備抗原，從20世紀(jì)90年代初期至今，抗HEV特異性IgM和IgG抗體的檢測(cè)仍然是通過(guò)分子生物學(xué)方法合成HEV重組蛋白或合成肽作為抗原，在20多年的臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)一些AHE患者抗-HEV IgM和抗-HEV IgG陽(yáng)性規(guī)律、試劑的敏感性和可重復(fù)性不如其它自限性病毒，如甲型肝炎病毒等感染，其抗-HEV IgM和抗-HEV IgG血清學(xué)分布呈現(xiàn)多樣性，給臨床診斷帶來(lái)了困難。我們檢測(cè)了我院連續(xù)收集的217例AHE患者血清，分析歸納了抗-HEV IgM、抗HEV-IgG和HEV RNA的分布模式和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，希望能為臨床診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 2016年1月～2018年3月于我院診治的AHE患者217例，男性122例，女性95例；平均年齡為48.63±16.28歲。納入滿(mǎn)足以下三項(xiàng)條件之一者：1)臨床表現(xiàn)為急性肝炎全身和胃腸道癥狀，或有黃疸，無(wú)慢性肝炎病史；2)血生化檢查顯示ALT升高大于正常值上限2.5倍(正常上限為35 U/L)；3)血清學(xué)檢測(cè)顯示抗-HAV IgM、IgG均陰性，或抗-HAV IgM陰性而抗-HAV IgG 陽(yáng)性，血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc均陰性和HBV DNA陰性，或抗-HBs陽(yáng)性，或抗-HBs和抗-HBc兩項(xiàng)陽(yáng)性，或抗-HBs、抗-HBe 和抗-HBc三項(xiàng)陽(yáng)性，抗-HCV 陰性和HCV RNA陰性，抗EBV-IgM、EBV DNA 均陰性，抗CMV IgM、CMV DNA均陰性，抗-HEV IgM、抗-HEV IgG或 HEV RNA至少有一項(xiàng)陽(yáng)性者。排除其他病毒性、酒精性、自身免疫性、代謝性肝病和藥物性肝損傷等。

1.2 試劑與儀器 HEV RNA提取和FQ-PCR法檢測(cè)試劑盒由北京金豪制藥股份有限公司提供。ELISA法檢測(cè)血清抗HEV IgM和抗HEV IgG診斷試劑由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司提供(分別應(yīng)用基因重組HEV ORF2抗原和基因重組HEV ORF2/ORF3抗原)。熒光定量PCR分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 血清處理 3500×g離心10 min分離血清，置于-80℃冰箱凍存，避免反復(fù)凍融。核酸提?。涸?.5 ml離心管中先后加入助沉劑5μl和裂解液200 μl，加入血清100 μl(設(shè)陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照)，劇烈震蕩2 min，室溫靜置10 min。加入無(wú)水乙醇240 μl，顛倒混勻，將裂解混合物加入吸附柱，3500×g離心2 min，取下套管，倒掉套管中的液體，將吸附柱重新裝入套管，6000×g離心1 min，倒掉套管中的液體，將吸附柱再次重新裝入套管。加入洗液A 500μ l6000×g離心l min，將吸附柱換一個(gè)新套管。加入洗液B 500 μl，靜置l min，6000×g離心l min，倒掉套管中的液體，將吸附柱重新裝入套管。加入洗液B 500 μl，6000×g離心1 min，將吸附柱換一根新套管，15521×g離心3 min。將吸附柱裝入無(wú)核酸酶1.5 ml離心管，小心在吸附膜中央加入預(yù)熱洗脫液50 μl，室溫靜置4 min，9184×g 離心2 min，離心管中液體即為待檢純化的RNA。

1.4 血清HEV RNA檢測(cè) 采用熒光RT-PCR法檢測(cè)，在1.5 ml離心管中先后加入20 I×l HEV反應(yīng)液，0.6×Taq 聚合酶，AMV酶0.2μl，震蕩混勻，離心使液體聚至管底，以20μl/管分裝至熒光RT-PCR擴(kuò)增管。在熒光RT-PCR擴(kuò)增管中分別加入待檢純化RNA 10 μl，2000×g離心20 s，使液體聚至管底。將擴(kuò)增管放入熒光RT-PCR擴(kuò)增儀中，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄及變性:50℃ 30 min，95℃ 3 min；預(yù)擴(kuò)增: 95℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，共5個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增及熒光收集:95℃ 10 s，55℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)，在55℃收集FAM熒光信號(hào)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 血清病毒標(biāo)記物或核酸陽(yáng)性情況 見(jiàn)表1。

表1 217例AHE患者第一次檢測(cè)HEV分布(%)

2.2 75例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA二次檢測(cè)的變化 在217例患者中，我們對(duì)其中75例患者血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA進(jìn)行了為期15～76天(中位35天)隨訪(fǎng)。在首次檢測(cè)后第3～4周再次行血清檢測(cè)。在75例患者中，有1例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA均陽(yáng)性，24例抗-HEV IgM和抗HEV-IgG陽(yáng)性，27例單項(xiàng)抗-HEV IgG陽(yáng)性，1例單項(xiàng)抗-HEV IgM陽(yáng)性和1例抗-HEV IgG和HEV RNA均陽(yáng)性，在第3～4周復(fù)查時(shí)，保持血清標(biāo)記物或核酸陽(yáng)性不變；21例在隨訪(fǎng)過(guò)程中出現(xiàn)抗-HEV IgM和HEV RNA陰轉(zhuǎn)和/或抗-HEV IgG陽(yáng)轉(zhuǎn)；有3例血清抗-HEV IgM、IgG均陽(yáng)性患者分別在第29天、36天和40天出現(xiàn)抗-HEV IgM消失，其余患者血清學(xué)分布模式保持不變(表2)。

表2 75例AHE患者血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA陽(yáng)(%)性變化

2.3 部分病例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA動(dòng)態(tài)變化 在138例有明確的發(fā)病日期患者，血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA陽(yáng)性均最早出現(xiàn)在第2個(gè)病日。AHE患者血清 HEV RNA存在時(shí)間短，在第一病周陽(yáng)性率最高；血清抗-HEV IgM陽(yáng)性檢出率于第一病周最高，隨時(shí)間延長(zhǎng)檢出率逐漸下降；血清抗-HEV IgG陽(yáng)性檢出率在不同病周均高于HEV RNA和抗-HEV IgM，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)其陽(yáng)性檢出率不斷升高，第四病周和病程超過(guò)4周以后血清抗-HEV IgG陽(yáng)性檢出率達(dá)100.0%(表3)。

表3 不同病周血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA陽(yáng)性率(%)變化

3 討論

AHE是一種經(jīng)消化道傳播的急性病毒性肝炎，常見(jiàn)于發(fā)展中國(guó)家，在亞洲、非洲和我國(guó)新疆地區(qū)均有因水源污染而引起大規(guī)模暴發(fā)流行的報(bào)道。人群感染HEV后病死率為1%～2%，但在懷孕的婦女，病死率卻高達(dá)20%～25%[3-6]。AHE患者血清抗-HEV IgG和IgM陽(yáng)性具有多樣性[7-10]，抗-HEV IgG可同時(shí)出現(xiàn)于戊型肝炎的急性期和恢復(fù)期，抗-HEV IgM的反應(yīng)強(qiáng)度低于甲型肝炎，持續(xù)時(shí)間也較短，可在戊型肝炎急性期早期便已消失，甚至在發(fā)病時(shí)已檢測(cè)不到該指標(biāo)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因仍不清楚，可能與戊型肝炎本身潛伏期較長(zhǎng)，部分患者發(fā)病時(shí)抗-HEV IgG滴度已經(jīng)升高到較高的水平[11-14]。目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道采用ELISA診斷試劑檢測(cè)的靈敏度為45%～94%，特異性為73%～100%[15-17]。

本研究中，217例患者發(fā)病初期血清抗-HEV IgM、IgG、HEV RNA陽(yáng)性變化有一定的規(guī)律。按照急性自限性病毒現(xiàn)癥感染的血清學(xué)診斷依據(jù)，了解血清學(xué)陽(yáng)性規(guī)律可幫助診斷急性戊型肝炎。通過(guò)后期動(dòng)態(tài)隨訪(fǎng)，2例血清抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA均陰性患者轉(zhuǎn)變?yōu)榭?HEV IgM和IgG雙陽(yáng)性，因此也被診斷為AHE。然而，通過(guò)本研究患者起病時(shí)和后期的隨訪(fǎng)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，有一部分患者不管是急性期還是恢復(fù)期僅能檢測(cè)到抗-HEV IgG，對(duì)于檢測(cè)不到抗-HEV IgM，而僅抗-HEV IgG陽(yáng)性的患者，該如可評(píng)價(jià)呢？

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于抗-IgG陽(yáng)性作為臨床診斷AHE的意義認(rèn)識(shí)不盡相同[3，4，18]。有認(rèn)為部分戊型肝炎患者血清抗HEV IgG持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，可長(zhǎng)達(dá)數(shù)年之久，而且在正常人也可能由于過(guò)去感染而有3%～9%以上的低滴度陽(yáng)性人群，故只有抗HEV IgG由陰轉(zhuǎn)陽(yáng)或血清滴度有4倍以上升高時(shí)才有診斷意義。然而，抗 HEV IgG陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度有4倍及以上升高，這一指標(biāo)需定檢測(cè)雙份血清，不利于早期診斷，并且HEV感染的潛伏期相對(duì)較長(zhǎng)，多數(shù)患者就診時(shí)IgG抗體常已陽(yáng)轉(zhuǎn)并達(dá)到了較高的水平，因此該指標(biāo)用于診斷AHE的實(shí)用性較差。有研究發(fā)現(xiàn)AHE時(shí)IgG陽(yáng)性率可達(dá)86.5%(96/111)，持續(xù)時(shí)間短，恢復(fù)期僅6.3%(21/32)陽(yáng)性，故可用于戊型肝炎的診斷，一次陽(yáng)性即有意義。在臺(tái)灣13例AHE患者、271例健康人和160例其它肝病患者，采用RT-PCR法檢測(cè)血清HEV RNA，采用ELISA法檢測(cè)血清抗-HEV IgM和IgG，結(jié)果血清抗-HEV IgM和IgG診斷AHE的敏感性分別為92.1%和 98.6%，而特異性分別為92.1%和98.6%，認(rèn)為抗-HEV IgG對(duì)診斷HEV感染的敏感性和特異性較抗-HEV IgM更好，與HEV RNA有良好的一致性[19]。有人檢測(cè)7個(gè)城市143例散發(fā)性AHE患者急性期血清抗-HEV IgM和IgG的陽(yáng)性率分別為 100.0%和73.4%，抗-HEV IgM陽(yáng)性血清其抗-HEV IgG均為陽(yáng)性，未見(jiàn)單獨(dú)-HEV IgM陽(yáng)性者?？?HEV IgG于發(fā)病2周陽(yáng)性率為93.9%，認(rèn)為抗-HEV IgG作為診斷AHE的指標(biāo)較抗-HEV IgM更有意義。本組72例患者血清學(xué)表現(xiàn)為單獨(dú)抗IgG陽(yáng)性，但他們均有急性肝炎的臨床表現(xiàn)，并排除了藥物、酒精、代謝因素引起的肝損傷，也排除了其它噬肝病毒感染，如甲、乙、丙型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒和EB病毒感染，臨床可基本建立AHE診斷。為了進(jìn)一步弄清抗-HEV IgG、抗HEV-IgM和HEV RNA在AHE病程不同時(shí)期的陽(yáng)性檢出率，我們收集到138例有準(zhǔn)確發(fā)病日期的患者血清，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了抗-HEV IgM、IgG和HEV RNA變化的規(guī)律，結(jié)果提示血清HEV RNA總陽(yáng)性檢出率僅為17.4%，且在血清中存在時(shí)間短，主要集中在發(fā)病1周內(nèi)。相對(duì)于血清抗HEV-IgM，抗-HEV IgG在病程的不同時(shí)期陽(yáng)性檢出率更高，抗-HEV IgG在發(fā)病早期即可檢測(cè)出。本組血清抗-HEV IgG在發(fā)病第1周陽(yáng)性檢出率就達(dá)90.2%，并且隨時(shí)間延長(zhǎng)檢出率逐漸增高，在第4病周可達(dá)100%。由此可見(jiàn)，血清抗-HEV IgG對(duì)診斷AHE的敏感性明顯高于HEV RNA或抗HEV-IgM，對(duì)于單獨(dú)IgG陽(yáng)性且有急性肝炎表現(xiàn)的肝炎患者，在能排除其他病因?qū)е碌母窝缀?，可臨床診斷為AHE。