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        白藜蘆醇對(duì)部分肝切除術(shù)大鼠肝再生和肝組織NK細(xì)胞活性的影響*

        2020-11-17 04:14:42郭春霞劉蘇南
        實(shí)用肝臟病雜志 2020年6期
        關(guān)鍵詞:檢測(cè)

        李 偉,郭春霞,劉蘇南

        我國(guó)肝癌患病率較高,每年因患肝癌死亡的人數(shù)超過(guò)10萬(wàn)人[1,2]。目前,主要的治療肝癌方法為手術(shù)切除腫瘤,但大多數(shù)患者在就診時(shí)已是中晚期,且合并有肝硬化、剩余健康肝組織較少,影響了手術(shù)的進(jìn)行。在正常情況下,肝臟細(xì)胞的增殖指數(shù)很低。當(dāng)肝臟組織遭遇損傷,如肝臟切除時(shí),肝臟則表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生能力。肝臟再生能力的強(qiáng)弱對(duì)于患者的預(yù)后具有重要的意義[3]。因此,肝臟再生的機(jī)制和如何促進(jìn)肝臟大部分切除后迅速再生是目前研究的熱點(diǎn)。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是非黃酮類的多酚化合物,具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗氧化等作用[4]。同時(shí),RES對(duì)肝再生(liver regeneration, LR)也有一定的影響[5]。但目前關(guān)于RES對(duì)LR和肝臟自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞的影響研究,觀點(diǎn)尚不完全統(tǒng)一。本文旨在研究RES對(duì)肝部分切除大鼠術(shù)后LR和肝組織NK細(xì)胞活性變化的影響,以期了解RES對(duì)肝臟保護(hù)作用的機(jī)理,從而為肝臟疾病的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物、藥物、試劑與儀器 90只SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(粵監(jiān)證字 2018A029號(hào)),在本院實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度為22~25℃,濕度50%~60%,明暗交替12 h,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,且本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)減少(reduction)、優(yōu)化(refinement)和替代(replacement),即3R原則。白藜蘆醇(純度>98%)購(gòu)自上海生工生物有限公司;抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司;抗CyclinDl抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和總蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海貝博生物;抗FcγRⅡ/Ⅲ抗體和小鼠抗大鼠CD3抗體購(gòu)自美國(guó)Catltag公司;蒸汽滅菌鍋購(gòu)自上海醫(yī)用儀器廠;動(dòng)物電子稱重儀(型號(hào):BK 8801B)購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司;WB試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;電子天平(型號(hào):BS-124s)購(gòu)自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司;正置型金相顯微鏡(型號(hào):SG-51)購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠;低溫離心機(jī)(型號(hào):TGL-16M)購(gòu)自濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司;轉(zhuǎn)膜儀和蛋白電泳購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于以色列DNR公司;實(shí)驗(yàn)室切片(型號(hào):LD-66)機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙益廣制藥機(jī)械公司;XH-600γ計(jì)數(shù)儀購(gòu)自西安市國(guó)營(yíng)二六二廠;流式細(xì)胞儀(型號(hào):Attune NxT)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

        1.2 動(dòng)物分組與藥物干預(yù) 將90只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,參考Gershbein et al[6]報(bào)道的方法,制備大鼠肝臟切除模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為對(duì)照組、小劑量白藜蘆醇和大劑量白藜蘆醇處理組,每組30只。在術(shù)前5 d,在小、大劑量白藜蘆醇處理組大鼠,分別給予白藜蘆醇10 g.kg-1·d-1和20 g.kg-1·d-1尾靜脈注射,在對(duì)照組,經(jīng)尾靜脈注射等量的生理鹽水。術(shù)前禁食12 h,不禁飲,給予5%水合氯醛0.5 ml/100 g經(jīng)尾靜脈注射麻醉,將大鼠以仰臥位固定于自制手術(shù)臺(tái)上,在切口周圍備皮,并以安爾碘消毒,取上腹正中切口,于劍突下切開皮膚、肌肉和腹膜,切口長(zhǎng)約2.0~4.0 cm,拉開并暴露腹腔,在腰背部墊一腰橋,暴露肝臟和肝門,用無(wú)菌棉簽于肝十二指腸韌帶前筋膜分離門靜脈,行70%大鼠肝葉切除術(shù),術(shù)中用6-0絲線在遠(yuǎn)離肝葉血管蒂根部依次縫扎肝左外葉、肝中葉、肝尾狀葉和肝蒂,術(shù)畢消毒。

        1.3 肝再生指數(shù)檢測(cè)[7]在術(shù)后24 h和48 h,經(jīng)乙醚麻醉后采用針刺心臟放血法每組分別處死15只大鼠,擦拭肝臟表面的血跡后檢測(cè)肝臟質(zhì)量,使用電子稱測(cè)量大鼠肝臟濕質(zhì)量,在門靜脈結(jié)扎組大鼠分別要減去結(jié)扎肝葉的肝質(zhì)量,并計(jì)算肝臟再生指數(shù)。肝再生指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

        1.4 大鼠肝組織NK細(xì)胞百分率檢測(cè)[8]取大鼠肝臟,切碎后使用濾網(wǎng)過(guò)濾,收集細(xì)胞懸液,使用pH為7.6、濃度為0.83%NH4CI-Tris緩沖液溶血。將溶解的細(xì)胞懸液加入離心管,1000 g離心2 min,棄上清液,加入抗FcγRⅡ/Ⅲ抗體10 μL,在4℃條件下培育10 min,再加入抗大鼠IgG抗體和抗CD3抗體10 μL,加入碘化丙啶5 μL,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠NK細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算NK細(xì)胞百分比。

        1.5 大鼠肝臟NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) 采用51Cr釋放法檢測(cè),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的YAC-1細(xì)胞,加入2.22×106BqMCr,用RPMI-1640補(bǔ)充體積到200 μL,37℃條件下孵育120 min,用RPMI-1640洗滌3次,配制成1×105/ml的細(xì)胞懸液。NK和YAC-l細(xì)胞混合比例為50:1,4 h后取上清液100 μL,使用XH-600γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定放射性活性(cpm),計(jì)算NK細(xì)胞特異性殺率。

        1.6 肝組織蛋白表達(dá)檢測(cè)[9]采用Western blot法,檢測(cè)大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。取大鼠肝臟組織消化后,提取總蛋白,轉(zhuǎn)移到PVDF膜,室溫封閉2 h后加入各需要檢測(cè)蛋白的一抗和二抗,孵育2 h,以β-actin為內(nèi)參蛋白,檢測(cè)蛋白灰度值/β-actin灰度值為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SigmaStat 3.5軟件,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠肝臟再生指數(shù)比較 在實(shí)驗(yàn)24 h和48 h,白藜蘆醇處理組大鼠肝臟再生指數(shù)顯著升高(P<0.05),且隨著劑量增加而升高(P<0.05,表1)。

        表1 各組大鼠肝臟再生指數(shù)比較

        2.2 各組大鼠肝臟NK細(xì)胞百分率和NK細(xì)胞活性比較 在實(shí)驗(yàn)24 h和48 h,白藜蘆醇處理組大鼠肝臟NK細(xì)胞百分率和NK細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05),且隨著劑量增加而升高(P<0.05,表2)。

        表2 各組大鼠肝臟NK細(xì)胞百分率和細(xì)胞活性比較

        2.3 各組大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)比較 在實(shí)驗(yàn)24 h和48 h,白藜蘆醇處理組大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05),且隨著劑量增加而升高(P<0.05,圖1)。

        圖1 各組大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)

        3 討論

        肝臟受到損傷或者肝臟在遇到外界干擾和刺激后,微環(huán)境會(huì)發(fā)生改變,使得其對(duì)受損細(xì)胞的清除和對(duì)損傷較輕細(xì)胞的修復(fù)能力發(fā)生了改變,最終使得其再生能力強(qiáng)于一般組織,被稱之為L(zhǎng)R[10]。雖然肝臟具有LR功能,但如何促進(jìn)其再生成為研究的難點(diǎn)。在肝葉切除圍手術(shù)期的肝再生、肝臟保護(hù)、移植肝組織的活性等問(wèn)題卻仍在一定程度上限制了該領(lǐng)域手術(shù)的開展。RES處理后對(duì)肝臟具有消炎的作用,可以減輕肝竇微血管的淤血和水腫,使得肝竇的修復(fù)能力增強(qiáng),同時(shí)可以改善肝細(xì)胞術(shù)后微循環(huán)灌注障礙[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)24 h和48 h,與對(duì)照組比,小劑量白藜蘆醇處理組大鼠肝臟再生指數(shù)顯著升高(P<0.05),且48 h時(shí)大鼠肝臟再生指數(shù)高于24 h時(shí),說(shuō)明使用RES處理后大鼠肝臟再生能力顯著提高。有研究表明,RES可以促進(jìn)肝細(xì)胞的再生能力[13],本研究得出的結(jié)論與其相一致。

        肝臟含有豐富的免疫功能細(xì)胞,具有獨(dú)特的免疫系統(tǒng),也是機(jī)體最大的免疫功能器官[14]。當(dāng)肝臟受損后會(huì)直接影響到免疫功能,同時(shí)嚴(yán)重影響到免疫相關(guān)細(xì)胞的活性和數(shù)量[15]。目前,常見的免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和第三類淋巴細(xì)胞,即NK細(xì)胞[16]。NK細(xì)胞不僅可以作為殺死腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞,同時(shí)可以通過(guò)釋放細(xì)胞因子,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[17]。本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠肝組織NK細(xì)胞百分率及其活性,發(fā)現(xiàn)小劑量白藜蘆醇處理組大鼠NK細(xì)胞百分率和NK細(xì)胞殺傷活力均顯著升高,說(shuō)明使用RES后,大鼠免疫功能得到了顯著的改善,不僅可以減輕肝臟的炎性反應(yīng),同時(shí)還可以改善免疫功能,促進(jìn)肝臟恢復(fù)。

        Cyclin D1是特異性周期蛋白-D1,是高度保守的細(xì)胞周期家族[18]。該家族在整個(gè)細(xì)胞周期中蛋白豐度具有周期性變化,同時(shí)該蛋白也是肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞增殖周期的主要標(biāo)志物,Cyclin D1的表達(dá)和活化是增殖階段一個(gè)重要的調(diào)控位點(diǎn)[19,20]。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所需的一種DNA多聚合酶δ的輔助蛋白,它與細(xì)胞周期密切相關(guān),直接參與細(xì)胞增殖過(guò)程中DNA的復(fù)制,其含量和表達(dá)程度變化與DNA合成情況一致,反映了細(xì)胞的增殖活性[21,22]。本研究發(fā)現(xiàn),使用RES大鼠肝組織PCNA和CyclinD1蛋白表達(dá)水平均顯著升高,可能是因?yàn)镽ES具有活血化瘀的作用,減輕了肝組織肝竇微血管的淤血和水腫,改善了肝臟血流動(dòng)力學(xué),促進(jìn)了肝臟血流循環(huán),使得肝臟在術(shù)后得到了快速的恢復(fù)。

        綜上所述,RES可以促進(jìn)大鼠肝部分切除術(shù)后肝組織NK細(xì)胞活性,促進(jìn)肝臟再生,其作用機(jī)制可能與RES可以減輕肝竇微血管淤血和水腫,使得肝竇的修復(fù)能力增強(qiáng),改善了術(shù)后微循環(huán)灌注障礙,增強(qiáng)了大鼠肝組織NK細(xì)胞的活力有關(guān)。本研究也存在一定的不足之處,比如在肝臟受損后,肝臟細(xì)胞及其微環(huán)境是如何啟動(dòng)再生機(jī)制、早期肝細(xì)胞增殖,DNA復(fù)制的關(guān)鍵基因及其相關(guān)信號(hào)因子通路是什么,本研究尚未討論,在后續(xù)的研究中將根據(jù)此思路進(jìn)一步深入探究這些問(wèn)題。

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